Транспорт s1: SDH STM 1 полнофункциональный оптический мультиплексор Транспорт S1

Tacoma, проект S2-S1-AQ1 type — FleetPhoto

 

Table of vessels of type

Order by: Date of Built  ·  Place of Built  ·  Year and Place of Built  ·  Modification  ·  Last Name  ·  First Name  ·  Editor’s order

Yard Nr	Built	Wdwn.	Name	Date	Port	Owner
519	08.09.1943	31.03.1968	Shii	31.03.1967	Japanese Navy	ВМС Японии
				01.09.1957
				01.07.1954
				30.11.1953	Kaijyou hoanchou	Береговая охрана Японии
			Long Beach	17.02.1950	United States Navy	ВМС США
			EK-2	13.02.1945	ВМФ СССР	Краснознамённый Тихоокеанский флот ВМФ СССР / Тихоокеанский флот ВМФ СССР / Морские силы Дальнего Востока / Морские силы Дальневосточной республики / Красная Сибирская флотилия
			Long Beach	15. 04.1943	United States Navy	ВМС США
521	01.10.1943		Tahchin	22.06.2000	Sattahip	Monuments
				????	Royal Thai Navy	ВМС Таиланда
				29.10.1951
			Glendale	17.02.1950	United States Navy	ВМС США
			EK-6	13.02.1945	ВМФ СССР	Краснознамённый Тихоокеанский флот ВМФ СССР / Тихоокеанский флот ВМФ СССР / Морские силы Дальнего Востока / Морские силы Дальневосточной республики / Красная Сибирская флотилия
			Glendale	13.04.1943	United States Navy	ВМС США

Report a mistake in type’s/project’s description or name

«denon dp s1 cd %d0%a2%d1%80%d0%b0%d0%bd%d1%81%d0%bf%d0%be%d1%80%d1%82 %d0%ba%d0%be%d0%bc%d0%bf%d0%bb%d0%b5%d0%ba%d1%82 %d0%ba%d0%b0%d0%b1%d0%b5%d0%bb%d0%b5%d0%b9» на интернет-аукционе Мешок

S. TANEYEV Symphony No. 4 A. GAUK 12NE RU81 247.00 р. Москва    самовывоз Продавец: ACCHORD (1369)
1x IEEE1394a и 2x USB 2.0 планка для задней стенки корпуса компьютера ASUS-6433 175.00 р. Торг уместен Пятигорск    265.00 р Окончание торгов: 21/10 11:53 Продавец: Вячеслав_79 (5291)
CD MATTAFIX — SIGNS OF A STRUGGLE (R&B, HIP HOP, DANCEHALL) (Ч.Л.) 90.00 р. Калининград    договорная Окончание торгов: 18/11 09:33 Продавец: Сергей Л. (780)
1CD RED TRAY (тип2) КРАСНЫЙ ТРЕЙ для JEWEL CASE BOX 50. 00 р. Москва    250.00 р 1 штука продана Продавец: CD (836)
Anthrax Attack Of The Killer B’s 1 CD ФИРМА 615.00 р. Москва     самовывоз Окончание торгов: 2 дня Продавец: YO2001 (2998)
Картридж-головка звукоснимателя МС Denon DL-S1 комплект (рабочий !) Япония 45000.00 р. Торг уместен Москва    самовывоз Окончание торгов: 06/12 16:21 Продавец: indy_73 (776)
Пакистан 1961-70 Хайберский перевал, Сады Шалимара Sc#O76,O77b,O78a,O79b,O81a,O82a,O84,O86a Used 70.00 р. Санкт-Петербург     70. 00 р Окончание торгов: 27/11 21:29 Продавец: bookman_2008 (576)
Кабель соединительный USB2.0 A вилка- USB B вилка, 1.5м 50.00 р. Тосно    договорная Окончание торгов: 21/10 10:05 Продавец: BeerBoy84 (731)
15 монет..Третий рейх.2 марки 1939АПфенниги 50 1943.10 1942A. 2 1941B.1 1941A,1942A,1943A,1944A1944B 1050.00 р. Москва     договорная Окончание торгов: 02/12 19:08 Продавец: квс9 (2246)
Def Leppard ‎– Pyromania / LP-UK-1983 / INS./ 1st.Press / ORIG./ A-2 / B-2 / EX / EX 2400.00 р. Березовский    350.00 р Окончание торгов: 04/12 13:52 Продавец: VINYL19 (673)
Genesis — Trespass (LP, Album) UK 1st press A-2U/B-2U matrices, lyrics insert, EX+/NM 15000. 00 р. Санкт-Петербург    500.00 р Окончание торгов: 30/10 15:49 Продавец: diarmind (125)
Кабель соединительный USB2.0 A вилка- USB B вилка, 1.8м 50.00 р. Тосно    договорная Окончание торгов: 21/10 10:05 Продавец: BeerBoy84 (731)
Кабель соединительный Defender USB2.0 A вилка- USB B вилка, 1.8м 50.00 р. Тосно    договорная Окончание торгов: 21/10 10:05 Продавец: BeerBoy84 (731)
Кабель соединительный USB2.0 A вилка- USB B вилка, 1.8м 50.00 р. Тосно    договорная Окончание торгов: 21/10 10:05 Продавец: BeerBoy84 (731)
Кабель соединительный USB2. 0 A вилка- USB B вилка, 1.8м 50.00 р. Тосно    договорная Окончание торгов: 21/10 10:05 Продавец: BeerBoy84 (731)
Германия 1937 год 1 пф F-D-E-A №2 (А9) 250.00 р. Москва    самовывоз Окончание торгов: 12/10 16:33 Продавец: AndrCh58 (5508)
Led Zeppelin Houses Of The Holy EX+/EX+ UK OIS Atlantic ‎– K50014 A2 STERLING, B2 STERLING 3800.00 р. Екатеринбург    350.00 р Окончание торгов: 03/11 13:44 Продавец: VinylOZh (2191)
пластинка TIBOR SARAI A1. Music For 45 Strings. A2. String Quartet No. 1. B. Symphony No. 2. -4 250.00 р. Киров    250.00 р Продавец: НИКА-5 (622)
Италия / Тоскана / 1 сентесимо / 1859 г. / 0.99 гр. / Cu / VF+ / KM 81 / 3003.75 р. Торг уместен Челябинск    договорная Продавец: Bosporshop (3245)
Uriah Heep ‎– Salisbury / LP-UK-1971 / ILPS-9152 / ORIG./ GATF./ A-2U / B-2U 3200.00 р. Березовский    350.00 р Окончание торгов: 26/10 19:48 Продавец: VINYL19 (673)
Уточните поиск:  5 копеек CCCP CD-диск UNC Англия биметалл Винил винтаж животные иностранные монеты коллекционирование Коллекционирование коллекция КПД Ленин Лицензионный CD Лицензия масштабные модели медная монета металл музыкальный диск набор недорого нечастая оригинал Оригинал отличное состояние персоналии подарок Почтовые марки президент птица раритет Редкая монета редкие редкость Российская Империя серебро состояние сохран СССР США фауна Фауна филателия Царская Россия экзотика эмаль юбилейные Юго-Восточная Азия Еще. ..
FREE ,Heartbreaker , LP ,UK 1972 ,1st press,A2U B2U ,NM/EX+,lp / cover 3500.00 р. Орел    250.00 р Окончание торгов: 17/11 19:12 Продавец: antonovka23 (508)
Кабель соединительный USB2.0 A вилка- USB B вилка. HC-U-8014 50.00 р. Торг уместен Тосно    договорная Окончание торгов: 21/10 10:05 Продавец: BeerBoy84 (731)
VARIOUS ARTISTS — ZYX ITALO DISCO COLLECTION — THE EARLY 80S (3 CD) (Germany) — ZYX 82187-2 — NEW 1349.00 р. Ярославль    договорная Продавец: Лесенка (1148)
Аргентина 50 песо 1977 года P-301a (2) серия B UNC 55. 00 р. Москва    80.00 р 2 штуки продано Продавец: DDS2013 (8997)
☆~ЗВЕРОПОЛИС 3D+2D ~☆Колл.Изд.( 2x Blu-Ray)+СЛИП/Кейс! Сони ДАДС ! Лицензия, Запечатан ! Дисней ! 5 290.00 р. Москва    135.00 р Окончание торгов: 14/11 23:28 Продавец: Гарик448 (540)
Canon PowerShot S1 is PC1058 LCD 2CF4B10228 плата 419.00 р. Керчь    99.00 р Окончание торгов: 16/10 00:25 Продавец: Remontlife (149)
Dieter Thomas Heck (1 песня-D.Bohlen) 2006 2CD 250.00 р. Химки    250. 00 р Окончание торгов: 14/10 09:03 Продавец: fitja (3658)
MARILLION REAL TO REEL 1984 UK PRESS 12″ VINYL RECORD A2U/B2U EX/EX 1599.00 р.  0 ставок Пушкин    250.00 р Окончание торгов: 12/10 21:26 Продавец: valery-seawolf (3191)
Can ‎– Soon Over Babaluma (UK) A 2U B 2U / NM 3890.00 р. Пенза    договорная Окончание торгов: 1 день Продавец: kirdelon (1078)
США 1 цент D 1998 a1451 10.00 р. Владикавказ    130.00 р Окончание торгов: 13/10 12:43 Продавец: wasp1978 (2349)
США 1 цент D 2002 a1453 10. 00 р. Владикавказ    130.00 р Окончание торгов: 13/10 12:43 Продавец: wasp1978 (2349)
США 1 цент D 1984 a1446 10.00 р. Владикавказ    130.00 р Окончание торгов: 13/10 12:43 Продавец: wasp1978 (2349)
США 1 цент D 2000 a1477 12.00 р. Владикавказ    130.00 р Окончание торгов: 13/10 12:42 Продавец: wasp1978 (2349)
США 1 цент D 2006 a1478 12.00 р. Владикавказ    130.00 р Окончание торгов: 13/10 12:42 Продавец: wasp1978 (2349)
США 1 цент D 2007 a1479 12. 00 р. Владикавказ    130.00 р Окончание торгов: 13/10 12:42 Продавец: wasp1978 (2349)
HAWKWIND IN SEARCH OF SPACE 1971 UK 12″ VINYL RECORD LP A2U/B4U WITH LOG BOOK 3499.00 р.  0 ставок Пушкин    250.00 р Окончание торгов: 12/10 21:30 Продавец: valery-seawolf (3191)
Реле указательное токовое РУ-1-11У3 0.01А и 2.5А 200.00 р. Торг уместен Волгодонск    договорная Продавец: Mokosan (422)
Лаос 1 кип 1962 840 АЗ-2 80р 80. 00 р. Москва    самовывоз Окончание торгов: 26/10 16:12 Продавец: l_margo (2076)
Лаос 1 кип 1962 841 АЗ-2 80р 80.00 р. Москва    самовывоз Окончание торгов: 26/10 16:12 Продавец: l_margo (2076)
DODGY-,,Homegrown,, 1994 JAPAN CD (Indie rock) A2 350.00 р.  0 ставок 600.00 р.  блиц-цена Выкса    200.00 р Окончание торгов: 11/10 09:12 Продавец: brat52 (1469)
Франция 1 сантим Дюпре LANE-A 2 1797-1803гг 450.00 р.  0 ставок 494.00 р.  блиц-цена Иваново    100. 00 р Окончание торгов: 18/10 19:04 Продавец: dab333 (1762)
TRAVELING WILBURYS Vol.1 CD Japan 25P2-2327 PROMO SAMPLE 1st press Petty Lynne 19.99$ Торг уместен Киров    3.12$ Окончание торгов: 26/10 10:08 Продавец: buycds (320)
вкладыши КОМИКСЫ 1 штука cS (305a) ..2.. 40.00 р.  0 ставок 50.00 р.  блиц-цена Тамбов    150.00 р Окончание торгов: 2 дня Продавец: муравейНИК (2032)
2 двигателя 1 лотом на магнитофоны. ДП40-0.16-2-9-Д20-У2.1 300.00 р.  0 ставок Итатский    400.00 р Окончание торгов: 13/10 22:19 Продавец: АФ163 (861)
A-ha Foot Of The Mountain 1 CD ФИРМА 872. 00 р. Москва    самовывоз Окончание торгов: 2 дня Продавец: YO2001 (2998)
A-ha Cast In Steel 1 CD ФИРМА 872.00 р. Москва    самовывоз Окончание торгов: 2 дня Продавец: YO2001 (2998)
DENON DP-59L-топ-модель 1984 года в оригинальной коробке!!! 119999.00 р.  0 ставок Саратов    договорная Окончание торгов: 28/10 12:31 Продавец: blackops11 (389)
(b21040456) ТИБЕТ — ШО 1927 BE16-1 / Y21a 2/3 тангка танка 599.00 р. Торг уместен Воронеж    договорная Продавец: novatrade (5355)
CD Various ‎ Disco 80’s Rare & Special Versions Vol. 1 Disco 80s Rec.(GB) ‎– D80R061 Europe 2016 1000.00 р.  0 ставок 1100.00 р.  блиц-цена Пермь    150.00 р Окончание торгов: 12/10 23:11 Продавец: Avi_norge (4981)
CD Various ‎Disco 80’s Rare & Special Versions Vol. 1 Disco 80s Records ‎(GB) – D80R061 NEW Sealed 1200.00 р.  0 ставок 1300.00 р.  блиц-цена Пермь    150.00 р Окончание торгов: 19/10 17:53 Продавец: Avi_norge (4981)

ONKYO ND-S1 — цифровой медиа-транспорт для iPod

Расширяя многообразие доступных пользователям развлекательных форматов, Onkyo разработала усовершенствованное интерфейсное устройство нового поколения для включения плееров iPod в домашние развлекательные системы. Основной упор в этом интерфейсе для iPod сделан на качестве звука, и поэтому новое устройство названо цифровым медиа транспортом. Onkyo ND-S1 обеспечивает не только бесшовную связь портативного медиа-плеера с вашим домашним театром, но и позволяет вам одним нажатием кнопки синхронизировать содержимое iPod с сервисом iTunes. Всего один USB кабель соединяет ND-S1 с вашим компьютером PC, а одиночный цифровой аудио выход подключается на вход совместимого A/V ресивера, усилителя с ЦАП (A-5VL)  или мини-системы. Гарантируется точная и бережная передача цифрового звука высокого разрешения, благодаря цифровому приемопередатчику Burr-Brown и прецизионному тактовому генератору.

Добавив цифровой медиа транспорт ND—S1 к AV или hi—fi системе (имеющей ЦАП), вы можете превратить карманный плеер iPod в универсальный мультимедиа-сервер аудиофильского уровня.

 

• Легко обеспечивает связь с iPod touch (1-го и 2-го поколения), iPod classic, iPod (5-го поколения*), iPod nano (1-го*, 2-го, 3-го и 4-го поколения)

• Цифровой приемопередатчик Burr-Brown для цифрового звука высокого разрешения

• Прецизионный тактовый генератор (±10 ppm) для высокоточной цифровой обработки

• Совместная работа с AV системами Onkyo, оснащенными USB портом и AV разъемами

• Воспроизведение видео с iPod

• Переключатель синхронизации/десинхронизации с iTunes

• Аудио селектор (iPod/PC)

• Функции Resume Music и Video Playback

• Случайное воспроизведение песен/альбомов, повтор (1 трек/все)

• Авто включение

• Цифровые выходы (оптический/коаксиальный), USB порт

• Композитный видео выход

• Функция Direct Change (автоматическое переключение

входного источника на iPod)

• Функция подзарядки плееров iPod

• Дистанционное управление с RI-совместимых пультов AV систем Onkyo

• Эксклюзивный пульт ДУ в комплекте

• Размеры: 205 x 175 х 35 мм

CSF-1 стимулирует транспорт нуклеозидов в макрофагах S1

Мы исследовали транспорт нуклеозидов (NT) в клеточной линии, полученной из первичных макрофагов костного мозга мышей на 7 день (макрофаги S1) в ответ на фактор роста макрофагов, колониестимулирующий фактор 1 (CSF-1). Транспорт аденозина и уридина в покоящихся макрофагах S1 происходил главным образом по двум облегченным диффузионным путям, один из которых был чувствительным, а другой — относительно устойчивым к ингибитору нитробензилтиоинозину (NBMPR).Добавление CSF-1 к покоящимся культурам приводило к увеличению транспорта аденозина и уридина с двухфазной кинетикой по отношению к клеточному циклу. Базальная активность NT была увеличена (примерно в два раза) в течение 15 минут после добавления CSF-1, вернулась к почти базальным уровням через 1 час, а затем снова увеличилась (в три-четыре раза) через 8-12 часов, снова вернувшись к базальным уровням через 48 часов. ч после стимуляции CSF-1. Мы предполагаем, что значительное увеличение активности NT через 8–12 ч соответствовало времени, когда культуры синхронно начинали входить в S-фазу клеточного цикла.Помимо этих изменений абсолютных скоростей, пропорции NBMPR-чувствительного и NBMPR-нечувствительного транспорта также изменяются после добавления CSF-1. Покоящиеся культуры проявляли преимущественно NBMPR-нечувствительный транспорт, в то время как логритмически растущие культуры проявляли преимущественно NBMPR-чувствительную транспортную активность нуклеозидов. Увеличение NBMPR-чувствительного компонента процесса транспорта происходило параллельно с аналогичным увеличением количества высокоаффинных сайтов связывания NBMPR, предполагая, что механизм повышения регуляции NBMPR-чувствительной активности NT включает увеличение количества NBMPR-чувствительных сайтов-транспортеров.Интересно, что нам не удалось обнаружить Na (+) — зависимое концентрированное поглощение аденозина, уридина или формицина-B ни в клеточной линии макрофагов S1, ни в первичных (7-й день) мышиных макрофагах. Таким образом, эти полученные из костного мозга макрофаги не проявляли характерно больших Na (+) — зависимых транспортных систем, наблюдаемых другими в перитонеальных макрофагах, подразумевая, что эти две популяции макрофагов действительно функционально различны.

Транспорт и молекулярный механизм секреции (Раздел 1, Глава 10) Neuroscience Online: Электронный учебник для нейронаук | Кафедра нейробиологии и анатомии

10. 1 Введение

Как вы узнали в предыдущих главах, нейротрансмиссия происходит за счет секреции нейромедиатора из нервного окончания, влияющего на постсинаптическую клетку. В этой главе будут представлены биологические механизмы синаптической передачи, опосредованной пузырьками.

В течение последних двадцати лет стало очевидно, что весь трафик внутриклеточной мембраны основан на одних и тех же фундаментальных механизмах. Те же самые операции, вовлеченные в синтез и транспорт пузырьков в ER и аппарате Гольджи в соме, используются в модифицированном виде во время нейросекреции.Основное различие состоит в том, что трафик везикул, , , во время нейросекреции, регулируется, притоком Ca ^2+, , тогда как транспорт везикул во время синтеза и транспорта везикул — нет. Нерегулируемый оборот называется учредительный . В обоих случаях, однако, транспорт состоит из серии стадий, включающих почкование пузырьков, их стыковку с др. Органеллами и слияние с мембранами этих органелл. Эти процессы, как полагают, присутствуют во время биогенеза везикул, когда ER генерирует везикулы, которые сливаются с аппаратом Гольджи, когда эндосомы транспортируются к лизосомам и когда мембрана везикул повторно захватывается плазматической мембраной нервного окончания.Происходит отпочкование от их мембранного происхождения, движение к точке назначения и, наконец, стыковка пузырьков с органеллой-мишенью, где она прикрепляется и сливается с мембраной органеллы.

В этом разделе рассматривается жизнь везикулы нейротрансмиттера, начиная с его синтеза в клеточной соме, транспортировки к нервному окончанию и рециркуляции в нервном окончании. Белки везикул в конечном итоге возвращаются в сому клетки для повторного использования в синтезе новых везикул.

Рисунок 10.1 Мы обсудим пять этапов торговли нейротрансмиттерами.

Нажмите на блоки, отмеченные на этом Нейроне (вверху), чтобы увидеть детали, или выберите из списка ниже.

1. Синтез везикул и белков
2. Антероградный транспорт пузырьков
3. Секреторный механизм
4. Повторный захват пузырьков
5. Ретроградный аксоплазматический транспорт

10.2 Синтез везикул и белков

Рис. 10.2. Схематическое изображение органелл, вовлеченных в везикулу. Чтобы просмотреть процессы, участвующие в биосинтезе везикулярных белков, щелкните одну из структур.

Цикл везикул нейромедиатора начинается в ER, где синтезируются белки, составляющие везикулы. Биосинтез везикул продолжается по мере того, как белки мигрируют через гладкий ER и аппарат Гольджи, чтобы в конечном итоге выйти и транспортироваться к нервному окончанию.Внешний слой ядерной оболочки прилегает к эндоплазматической сети , которая, в свою очередь, прилегает к аппарату Гольджи .

10.3 Перинуклеарные цистерны и синтез рибосомных белков

Рисунок 10.3 Схематическое изображение участков синтеза клеточного белка. Щелкните (B) для анимации синтеза цитоплазматического белка.Щелкните (C) для анимации синтеза интегрального мембранного белка.

Как показано на рисунке 10.3, после того, как мРНК транскрибируется из ДНК в ядре, она мигрирует через поры ядерной оболочки, называемые перинуклеарными цистернами (метка (A) на рисунке 10.3). Когда мРНК достигает цитоплазмы, она встречает свободные рибосомы , помеченные (B). Это место синтеза цитоплазматического белка.Здесь триплетные комбинации нуклеотидов, называемые кодонами , транслируют мРНК в белок посредством механизма, при котором рибосомы считывают последовательность белка, закодированную в мРНК. По мере движения рибосом по матрице мРНК добавляются амино кислоты и синтезируется белок. Поскольку большинство молекул мРНК длиннее рибосомы, многие рибосомы могут считывать кодоны одной молекулы РНК.

Щелкните «B» на графике справа для анимации синтеза цитоплазматического белка.

Белки, которые должны быть связаны с мембранными структурами, такими как нейромедиатор , везикулы или плазмалемма , синтезируются на рибосомах внутри эндоплазматического ретикулума. Напомним, что присутствие рибосом определяет эту часть эндоплазматического ретикулума как грубый эндоплазматический ретикулум .

В (C) рисунка 10.3 синтезируемый полипептид (белок) не имеет сигнального пептида. Следовательно, этот белок станет не связанным с мембраной (растворимым) белком , который находится в просвете везикул.Находясь в просвете, белок подвергается дальнейшему процессингу, поскольку он проходит через гладкий ER, аппарат Гольджи и секреторный везикула , поскольку образуются зрелые секреторные белки.

Рис. 10.4. Схема отрастания пузырька из SER и слияния с аппаратом Гольджи.

В (D) фиг. 10.3 сигнал пептид является частью синтезируемого полипептида (на фигуре это обозначено тем фактом, что пептид закреплен в рибосомной мембране).Следовательно, этот белок будет интегральным мембранным белком . По мере того, как рибосома движется по матрице мРНК, добавляются аминокислоты. Сигнальный пептид вставляется в мембрану эндоплазматического ретикулума и поддерживает связь белка с мембраной. Это гарантирует, что белок будет ассоциироваться с везикулярной структурой, такой как везикула хранения нейромедиатора. Показывает синтез белка из рибосом в грубом ЭПР для синтеза белка, связанного с мембраной.

10.4 Грубая эндоплазматическая сеть

На рис. 10.4 показано движение секреторных пузырьков через шероховатый и гладкий ER. Гладкий ER простирается от RER и служит местом биосинтеза липидов для продукции эндосом , лизосом и плазматической мембраны , а также для везикул нейромедиатора. Новый мембранный белок, который начинает свой синтез в RER, продолжается в SER, где части SER отпочковываются, чтобы сформировать транспортные пузырьки, которые перемещаются к аппарату Гольджи со своим содержимым.

10,5 Гольджи

Рис. 10.5 Схема отрастания пузырька из аппарата Гольджи.

Как показано на рисунке 10.5, в аппарате Гольджи везикулы сливаются, образуя самые внешние из стопок цистерн аппарата Гольджи. Каждая цистерна ступенчато перемещается через аппарат Гольджи к вогнутой поверхности . Во время этой миграции белки становятся более концентрированными и претерпевают различные типы биохимических модификаций с образованием зрелых функциональных белков. Эти модификации включают фосфорилирование , гликозилирование , протеолиз и добавление жирных кислот, а также другие. Миграция происходит от цис-грани, близкой к SER, к вогнутой транс грани . Достигнув вогнутой поверхности, цистерны округляются в маленькие вакуоли, затем сливаются, образуя более крупную конденсирующую вакуоль .Конденсирующиеся вакуоли затем образуют ряд плотных сферических транспортных пузырьков. Эти везикулы отпочковываются и транспортируются в различные пункты назначения внутри нейрона, где они становятся клеточной мембраной, , лизосомами, эндосомами или везикулами нейротрансмиттеров.

10.6 Антероградный транспорт пузырьков

Рисунок 10. 6 Антероградный аксоплазматический транспорт, опосредованный кинезином ассоциация с микротрубочками.

Везикулы, образующиеся в соме клетки, перемещаются в то место, где они будут использоваться для синаптической передачи. Эта стадия транспортировки пузырьков обеспечивается процессом, называемым , быстрый антероградный аксоплазматический транспорт . Как показано на рисунке 10.6, транспорт опосредуется взаимодействием везикулы с микротрубочкой . Транспорт — это энергозависимый процесс, в котором так называемый моторный белок, , кинезин , связывается с пузырьками и перемещается вниз по микротрубочке в серии этапов прикрепления-отсоединения.Доказательства существования аксоплазматического транспорта получены из различных наблюдений, включая перемещение радиоактивных белков, синтезируемых в соме клетки, вниз по аксону к нервным окончаниям. Скорость транспорта 0,5-1,5 см в час. Ca ²⁺ также требуется для транспортировки. Алкалоиды барвинка , колхицин и винбластин , предотвращают аксоплазматический транспорт за счет разрушения микротрубочек.

10.7 Секреторный механизм

Как обсуждалось в главе 5, нейромедиатор секретируется в нервном окончании посредством Ca ²⁺ -зависимого слияния везикулы хранения нейромедиатора с плазматической мембраной, при этом нейромедиатор секретируется (высвобождается) в синаптическую щель для воздействия на постсинаптическую клетку.Этот процесс называется экзоцитозом. Возникает важная концепция, заключающаяся в том, что те же механизмы, которые происходят при слиянии пузырьков с мембранами в Golgi во время биосинтеза пузырьков, также используются в нервных окончаниях для высвобождения нейротрансмиттеров. Это верно для синтеза везикул. Даже очень простые клетки, такие как дрожжи. Это сохранение механизмов позволило использовать простые системы, чтобы помочь понять молекулярные механизмы высвобождения нейромедиаторов.

Рисунок 10.7 ступеней секреции нейромедиатора

Как показано на рисунке 10.7, первое событие, которое должно произойти (за исключением нейропептидных нейротрансмиттеров), — это заполнение пузырьков нейромедиатором посредством специфического поглощения нейромедиатора (NT Uptake). Об этом будет рассказано в следующих главах, в которых обсуждается каждый из конкретных нейротрансмиттеров.

Везикулы остаются в резерве до тех пор, пока они не потребуются для секреции.Когда это необходимо для секреции, происходит транслокация , которую также называют мобилизацией . Везикулы перемещаются в область плазматической мембраны, называемую активной зоной . Активная зона является местом высвобождения и характеризуется появлением плотного материала, прилегающего к плазматической мембране. Приток Ca ²⁺ , как полагают, увеличивает транслокацию за счет увеличения зависимого от Ca ²⁺ фосфорилирования везикуло-связывающего белка, называемого синапсин .Теория состоит в том, что Са ²⁺ зависимое фосфорилирование синапсина освобождает пузырьки от связывания с актиновыми микрофиламентами . Затем везикулы связываются с активной зоной плазматической мембраны, где они могут подвергнуться высвобождению своего нейромедиатора.

Связь везикулы с плазматической мембраной называется стыковкой, и служит для подготовки везикулы к секреции. Считается, что стыковка происходит за счет связывания белков мембраны везикул с белками плазматической мембраны.Некоторые из этих белков были обнаружены, поскольку они являются мишенями для бактериальных токсинов клостридий , которые блокируют синаптическую трансанимацию. Некоторые из этих токсинов и обнаруживаемые ими белки показаны в таблице I. Токсины настолько токсичны, что одна молекула может отравить весь нервный конец. Один из белков синаптических везикул — это VAMP , а два из белков синаптических плазматических мембран — это синтаксин и SNAP-25 .

Таблица I
Токсин	Синаптический белок	Расположение
Ботулотоксины A и E	SNAP-25	Синаптическая плазматическая мембрана
Ботулотоксин C1	Синтаксины	Синаптическая плазматическая мембрана
Ботулинический токсин B, D, F и G и столбнячный токсин	ВАМП	Синаптический пузырек

Третий белок плазматической мембраны, n-sec-1 , важен, потому что его слабая ассоциация с плазматической мембраной предотвращает связывание белков везикул нейромедиатора до тех пор, пока n-sec-1 не смещается (механизм n-sec-1). смещение с-1 в настоящее время не изучено).Этот и последующие этапы секреторного процесса показаны на рис. 10.8. Предполагается, что белки везикул и плазматической мембраны образуют комплекс друг с другом при замещении n-sec-1 с образованием «тримерного комплекса » (SNAP-25, синтаксин и VAMP). Этот трехчленный комплекс был изолирован и не поврежден от нервных окончаний животных. Эта ассоциация белков инициирует слияние. Везикулы на этом этапе готовы к высвобождению.

Рисунок 10.8 Схематическое изображение взаимодействия везикул и мембранных белков во время стыковки, слияния и деления синаптических везикул.

Заключительная стадия высвобождения, также показанная на рисунке 10.8, — это деление мембраны в точке контакта между везикулой и плазматической мембраной. Экзоцитоз нейромедиатора в синаптическую щель происходит, когда происходит это деление. Этот шаг стимулируется Ca ²⁺ , но механизм триггера Ca ²⁺ неизвестен.Одна из гипотез состоит в том, что белок везикул, называемый синаптотагмин , связывает Ca ²⁺ , чтобы инициировать деление. Поддержка синаптотагмина, как сенсора Ca ²⁺ , заключается в том, что он обладает двумя сайтами связывания для Ca ²⁺ . Дополнительные доказательства получены из исследований на мышах, у которых был отключен синаптотагмин. У этих мышей экзоцитоз синаптических везикул, запускаемый быстрым Ca ²⁺ , сильно ограничен. Многие аспекты механизма слияния-деления еще предстоит понять, в том числе: что вызывает диссоциацию n-sec-1 из комплекса, как Ca ²⁺ функционирует в процессе высвобождения и как все белки, участвующие в высвобождении повторно связываются с надлежащей мембраной после высвобождения, когда мембрана везикул повторно используется.

10.8 Повторный захват пузырьков

Хотя источником везикул для секреции нейромедиаторов является биосинтез в аппарате Гольджи в теле клетки, данные указывают на то, что локальный повторный синтез синаптических везикул является важным аспектом секреции нейромедиаторов. На рисунках 10.9 и 10.10 представлены две схематические сводки того, как везикулы повторно используются локально. Оба используют повторный захват мембраны пузырьков от нервного окончания. В одном случае везикулы отрываются от плазматической мембраны за счет образования ямок, которые мигрируют непосредственно, чтобы стать везикулой нейромедиатора, как только она может быть пополнена нейротрансмиттером в процессе захвата нейромедиатора.Это показано на рисунке 10.9. Этот механизм упоминается как « поцелуй и беги, », гипотеза . Второй механизм включает образование ямок, покрытых клатрином , чтобы повторно захватить мембрану везикул, и везикулы проходят цикл через эндосомный отсек в нервном окончании, прежде чем стать функциональными синаптическими пузырьками. Затем везикулы отрываются от эндосомы, образуя везикулу нейромедиатора. Это показано на рисунке 10.10. Считается, что оба механизма могут существовать в одном нервном окончании или может присутствовать только один из двух. Оба важны тем, что они восстанавливают белок везикул, чтобы обеспечить обильный запас для синаптической передачи. Этот механизм также предотвращает увеличение нервного окончания, которое могло бы произойти, если бы мембрана везикул не была повторно захвачена. Независимо от того, какой механизм задействован, снабжение и пополнение везикул может идти в ногу с высокой скоростью синаптической передачи только в течение нескольких минут.

Представление двух механизмов, предложенных для повторного захвата мембраны везикул во время секреции нейромедиаторов.

10.9 Ретроградный аксоплазматический транспорт

Рисунок 10.11. Ретроградный транспорт аксоплазмы, опосредованный ассоциацией динеина с микротрубочками.

В конце концов белки, используемые для синаптической передачи в нервном окончании, становятся мишенями и возвращаются в тело клетки нейрона для повторного использования с образованием нового белка и везикул.Белки возвращаются в сому посредством ретроградного аксоплазматического транспорта , который аналогичен антероградному транспорту, но использует другой моторный белок, динеин . Транспорт опосредуется взаимодействием динеина с микротрубочками и происходит несколько медленнее, чем скорость быстрого антероградного транспорта (0,2-1 см в день). Помимо возврата белков в сому, ретроградный транспорт служит средством связи между нервными окончаниями и сомой клетки.Это механизм транспортировки сигнальных молекул для регулирования развития и поддержания контактов аксонов с постсинаптическими клетками.

Рисунок 10.12 показывает сводку ретроградного и антероградного аксоплазматического транспорта. Он показывает моторные белки, кинезин и динеин , опосредующие движение пузырьков и митохондрий антероградно и пузырьков ретроградно вдоль микротрубочек . На анимации моторные белки показаны как часть транспортируемой органеллы.Другая возможная связь между моторным белком и микротрубочками состоит в том, что моторные белки являются частью микротрубочек и проходят везикулы вдоль микротрубочек.

Проверьте свои знания

Какой из следующих процессов определяет количество нейромедиатора, высвобождаемого из нервного окончания на краткосрочной, ежеминутной основе? (ПРИМЕЧАНИЕ: существует более одного правильного ответа.) А.Синтез нейротрансмиттеров ,00 Б. Синтез везикул в соме клетки C. Рециклинг пузырьков в нервном окончании D. Аксоплазматический транспорт E. Наличие кальция Какой из следующих процессов определяет количество нейромедиатора, высвобождаемого из нервного окончания на краткосрочной, ежеминутной основе? (ПРИМЕЧАНИЕ: существует более одного правильного ответа.) A. Синтез нейротрансмиттеров. Ответ ПРАВИЛЬНЫЙ! Поскольку в нервном окончании имеется только достаточное количество нейромедиатора в течение минуты или около того непрерывного высвобождения, биосинтез нового нейромедиатора для заполнения рециклированной везикулы нейротрансмиттера необходим для постоянной доступности нейромедиатора для высвобождения. Б. Синтез везикул в соме клетки С.Рециклинг пузырьков в нервном окончании D. Аксоплазматический транспорт E. Наличие кальция Какой из следующих процессов определяет количество нейромедиатора, высвобождаемого из нервного окончания на краткосрочной, ежеминутной основе? (ПРИМЕЧАНИЕ: существует более одного правильного ответа. ) A. Синтез нейротрансмиттеров Б.Синтез везикул в клеточной соме. Этот ответ НЕПРАВИЛЬНЫЙ. Синтез пузырьков в теле клетки необходим для снабжения нервных окончаний пузырьками для нейротрансмиссии на долгосрочной основе. На краткосрочной основе мембрана везикул подвергается повторному захвату, и везикулы локально восстанавливаются, чтобы их можно было использовать для продолжения нейротрансмиссии. C. Рециклинг пузырьков в нервном окончании D. Аксоплазматический транспорт E.Наличие кальция Какой из следующих процессов определяет количество нейромедиатора, высвобождаемого из нервного окончания на краткосрочной, ежеминутной основе? (ПРИМЕЧАНИЕ: существует более одного правильного ответа.) A. Синтез нейротрансмиттеров Б. Синтез везикул в соме клетки C. Рециркуляция пузырьков в нервном окончании. Ответ ПРАВИЛЬНЫЙ! Везикулы рециркулируют локально на нервном окончании.Рециркуляция может включать или не включать слияние с эндосомой. D. Аксоплазматический транспорт E. Наличие кальция Какой из следующих процессов определяет количество нейромедиатора, высвобождаемого из нервного окончания на краткосрочной, ежеминутной основе? (ПРИМЕЧАНИЕ: существует более одного правильного ответа.) A. Синтез нейротрансмиттеров Б.Синтез везикул в соме клетки ,00 C. Рециклинг пузырьков в нервном окончании D. Аксоплазматический транспорт. Этот ответ НЕПРАВИЛЬНЫЙ. Доставка новых пузырьков к нервному окончанию посредством аксоплазматического транспорта обеспечивает пузырьки, необходимые для нейротрансмиссии на долгосрочной основе. Рециркуляция пузырьков в нервном окончании — это механизм, который обеспечивает везикулы для нейротрансмиссии на краткосрочной основе. E.Наличие кальция Какой из следующих процессов определяет количество нейромедиатора, высвобождаемого из нервного окончания на краткосрочной, ежеминутной основе? (ПРИМЕЧАНИЕ: существует более одного правильного ответа.) A. Синтез нейротрансмиттеров Б. Синтез везикул в соме клетки C. Рециклинг пузырьков в нервном окончании Д.Аксоплазматический транспорт E. Наличие кальция. Ответ ПРАВИЛЬНЫЙ! Повышение уровня кальция в нервном окончании за счет притока внешнего кальция или высвобождения внутреннего кальция играет важную роль в инициации мобилизации пузырьков и экзоцитоза. В некоторых типах нейронов (нейроны, высвобождающие ацетилхолин и катехоламин) уровень кальция также регулирует биосинтез нейромедиаторов.

Количественное моделирование транспорта аминокислот и гомеостаза в клетках млекопитающих

Состав переносчика аминокислот в двух клеточных линиях

В качестве моделей для этого исследования мы выбрали две линии раковых клеток человека, а именно клетки рака легкого A549 и клетки глиомы U87-MG. потому что они широко используются и имеют различное тканевое происхождение.Чтобы качественно изучить набор переносчиков аминокислот в каждой клеточной линии и определить кандидатов для анализа транспорта, мы проанализировали общедоступные базы данных и использовали ОТ-ПЦР для определения экспрессии переносчиков аминокислот на транскриптомном уровне (рис. S1 и S2). Для каждого транспортера была произведена оценка качественной экспрессии. На втором этапе мы использовали антитела в сочетании с поверхностным биотинилированием, чтобы идентифицировать транспортеры, которые потенциально активны (рис. S1, S3 и S4). Поверхностное биотинилирование / вестерн-блоттинг было важной проверкой по двум причинам.Во-первых, уровни мРНК не всегда коррелировали с поверхностной экспрессией. Например, мРНК SNAT2 (симпортер Na ⁺ -AA для полярно-нейтральной АК) имеется в большом количестве, но ее белок с трудом может быть обнаружен на поверхности клетки в свежей среде, как показано ранее в клетках 143B ¹⁸ . Это также наблюдалось для клеток A549 и U87-MG (рис. S2 – S4). SNAT5 ( SLC38A5 , симпортер Na ⁺ -AA / антипортер H ⁺ для полярных нейтральных АК), напротив, имеет сильный сигнал при вестерн-блоттинге, но его мРНК практически не обнаруживается.Во-вторых, некоторые переносчики являются преимущественно лизосомными, например PAT1 ( SLC36A1 , протонный симпортер АК для малых нейтральных АК), но могут также встречаться на поверхности клетки в некоторых типах клеток ¹⁹ . Транспортерами, сильно экспрессировавшимися на поверхности клеток в обеих клеточных линиях, были: ASCT2 (антипортер для полярных нейтральных АК), 4F2hc ( SLC3A2 , связанная с транспортером субъединица трафика) и связанные с ним транспортеры LAT1 (антипортер для больших нейтральных АК), y ⁺ LAT2 (антипортер для нейтральных (+ Na ⁺ ) и катионных АК), xCT (глутамат-цистиновый антипортер) и симпортеры SNAT1 (симпортер Na ⁺ -АА для полярно нейтральных АК) и SNAT5. Кроме того, в клетках U87-MG присутствовали специфичные для клеток переносчики, такие как B ⁰ AT2 ( SLC6A15 , Na ⁺ -AA симпортер для нейтральных АК) и ASCT1 (антипортер для малых полярных нейтральных АК). Первоначальный обзор упрощает разработку и интерпретацию экспериментов с радиоактивным потоком, описанных в следующем абзаце.

Аминокислотная транспортная активность в клетках U87-MG

После каталогизации кандидатов-переносчиков в этом исследовании активность переносчиков аминокислот была количественно определена с использованием транспортных экспериментов с радиоактивно мечеными аминокислотами.В таблице S1 перечислены все условия транспортировки для определения конкретных перевозчиков. Переносчики аминокислот обычно принимают группы родственных аминокислот, такие как большие неполярные нейтральные, маленькие нейтральные, катионные и анионные ²⁰ . Чтобы захватить все переносчики аминокислот в клетке, мы использовали субстраты, покрывающие эти группы, а именно лейцин, глутамин, аланин, аргинин, глицин, пролин и глутамат. Чтобы различать отдельные переносчики, использовали анализ ионной зависимости, ингибиторов и аминокислотной конкуренции.Ионную зависимость анализировали путем замены Na ⁺ на непроницаемый органический катион N -метил-d-глюкамин ⁺ (NMDG) или на Li ⁺ непосредственно перед добавлением радиоактивно меченного субстрата. Нарушение транспорта лейцина в клетках U87-MG показано на рис. 2а. В экспериментах с ингибиторами заблокированные транспортеры показаны над полосой, а активные транспортеры — внутри полосы. Транспортеры имеют цветовую маркировку. Белые промежутки указывают на потенциально неразрешенную транспортную активность или неполное ингибирование, но они обычно были небольшими или были связаны с определенными ингибиторами, такими как 2-амино-2-норборнанкарбоновая кислота (BCH).Транспорт лейцина в значительной степени опосредован Na ⁺ -независимым транспортером LAT1, о чем свидетельствует его ингибирование специфическим ингибитором JPh303 ²¹ . Зависимое от Na ⁺ поглощение лейцина клетками U87-MG опосредовано переносчиком аминокислот с разветвленной цепью B ⁰ AT2 и обменником y ⁺ LAT2 — единственными Na ⁺ -зависимыми переносчиками BCAA. экспрессируется в клетках U87-MG. Их активность можно определить по фракции, ингибируемой лоратадином (B ⁰ AT2) ²² и аргинином (y ⁺ LAT2).Соответственно, захват лейцина полностью отменялся в присутствии JPh303 в транспортном буфере, не содержащем Na ⁺ . SNAT2 также может опосредовать транспорт лейцина, но его вклад, по оценке аминокислотного аналога N -метиламиноизомасляной кислоты (MeAIB) ²³ , был слишком мал, чтобы быть значимым. MeAIB — хорошо известный ингибитор SNAT1 / 2. Неспецифический аналог аминокислоты BCH ингибирует LAT1 / 2 и B ⁰ AT2, что объясняет его сильное влияние на поглощение лейцина.В совокупности это объясняет поглощение всего лейцина. Мы не анализировали транспорт ароматических аминокислот отдельно из-за полного перекрытия переносчиков, принимающих лейцин, в клетках U87-MG.

Рис. 2: Различение активности транспорта аминокислот в клетках глиомы U87-MG.

Транспорт [ ¹⁴ C] аминокислот показан для лейцина (100 мкМ, 2 мин, n [по столбцу] = 12, 12, 12, 6, 12, 12, 12, 10 , 12, 12, 15, 6; e = 3), b глутамин (100 мкМ, 2 мин, n = 12, 7, 9, 7, 8, 6, 6, 12, 11, 6 ; e = 3), c аланин (300 мкМ, 2 мин, n = 18, 9, 9, 10, 6, 6, 9, 11, 13, 15; e = 3), d пролин (100 мкМ, 6 мин, n = 12, 6, 6, 6, 6, 6, 9, 6; e = 3), e глицин (100 мкМ, 6 мин, n = 10, 9, 6, 6, 6, 6, 6, 6; e = 3), f глутамат (100 мкМ, 6 мин, n = 6, 6, 9, 7, 7 ; e = 3) и г аргинина (100 мкМ, 6 мин, n = 9, 8, 9, 9, 8, e = 3).Поглощение AA измеряли в буфере на основе Na ⁺ (белые квадраты над столбиками), буфере на основе NMDG ⁺ (черные квадраты над столбцами) или буфере на основе Li ⁺ (серые квадраты над столбцами). . В контрольных экспериментах ни ингибитор, ни конкурент не добавляли. За исключением NEM (10 мин преинкубации), ингибиторы и конкуренты добавляли вместе с субстратом в концентрациях, приведенных в таблице S1. Для облегчения анализа заблокированные транспортеры, относящиеся к клеточной линии, показаны над столбцами, а активные транспортеры показаны внутри столбца.Транспортеры имеют цветовую кодировку, как указано в легенде рисунка, белые промежутки указывают на неразрешенное несоответствие. Неспецифическое поглощение / связывание оценивали добавлением 10 мМ немеченого субстрата и вычитали из всех экспериментов. Для всех данных показаны среднее значение и 95% доверительный интервал. Односторонний дисперсионный анализ ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки был использован для анализа различий между группами. Группам, которые не считались отличными друг от друга, была присвоена одна и та же буква, значения p для всех сравнений перечислены в таблице S15.Аминокислоты показаны трехбуквенным кодом; BCH 2-амино-2-норборнанкарбоновая кислота, дигидрокаинат DHK; JPH JPh303, лоратадин, MeAIB N -метиламиноизомасляная кислота, NEM N -этилмалеимид, Org ORG25543, сульфасалазин SAS, TBOA dl- трео -β-бензилоксиаспартат, UCPH-UCPH-101.

В отличие от транспорта лейцина, поглощение глутамина в значительной степени опосредовано Na ⁺ -зависимыми переносчиками (рис. 2b). Глутамин является плохим субстратом для LAT1 и, соответственно, ингибирование JPh303 было небольшим.Небольшой компонент Na ⁺ -независимого поглощения глутамина был отнесен к LAT2 (SLC7A8). Часть поглощения глутамина ингибировалась MeAIB, что указывает на то, что этому способствовали либо SNAT1, либо SNAT2. Бетаин, который различает SNAT1 и SNAT2, не имел никакого эффекта, что позволяет предположить, что SNAT1 является доминирующим MeAIB-чувствительным переносчиком глутамина. Это также согласуется с отсутствием ингибирования MeAIB транспорта лейцина. Лоратадин использовали для определения доли поглощения глутамина, опосредованной B ⁰ AT2 ²² .Особенностью транспортеров глутамина SNAT3 (SLC38A3) и SNAT5 является их способность сохранять транспортную активность при замене NaCl на LiCl ¹¹ . Это подтверждается тем, что транспорт глутамина в LiCl выше, чем транспорт глутамина в отсутствие Na ⁺ . В отсутствие экспрессии SNAT3 (рис. S1) этот компонент был отнесен к SNAT5. Весь транспорт глутамина был чувствителен к ингибированию аланином, предполагая, что оставшееся Na ⁺ -зависимое поглощение опосредовано ASCT2, доминирующим переносчиком нейтральных аминокислот во всех раковых клетках ¹³ .Несмотря на значительные усилия, надежные специфические ингибиторы ASCT2 еще предстоит разработать ²⁴ , но оставшаяся транспортная активность была постоянной во всех условиях. Эти вклады учитывают все поглощение глутамина и, за исключением SNAT5, совпадают с данными по экспрессии мРНК.

Поглощение аланина (рис. 2c) также было в значительной степени зависимым от Na ⁺ и опосредовано тем же набором переносчиков, что и поглощение глутамина. Он был частично чувствителен к ингибированию MeAIB (SNAT1 / 2), аргинином (SNAT4 (SLC38A4) и y ⁺ LAT2) и лоратадином (B ⁰ AT2), но не JPh303 (LAT1) в соответствии со специфичностью субстрата. LAT1.Таким образом, небольшая активность поглощения, наблюдаемая в отсутствие Na ⁺ , была приписана LAT2. Родственный транспортер ASCT1 исключает глутамин, и в результате мы отнесли резистентную к глутамину часть транспорта аланина к ASCT1. Небольшой литий-зависимый компонент был отнесен к SNAT5. Оставшаяся большая часть была отнесена к ASCT2. Эти вклады составили все поглощение аланина.

Пролин (рис. 2d) и глицин (рис. 2e) часто имеют специфические переносчики, потому что они, как правило, являются плохими субстратами для переносчиков других аминокислот.Транспорт пролина полностью зависит от Na ⁺ , за исключением протон-зависимых переносчиков семейства SLC36 (PAT1–4, SLC36A1–4). Это упрощает интерпретацию ингибирования MeAIB, которое влияет на SNAT1 / 2 и PAT1 / 2. Ингибирование бетаином было менее сильным, чем MeAIB, что позволяет предположить, что SNAT1 был доминирующим переносчиком пролина. Мы отнесли аргинин-чувствительную часть поглощения пролина к SNAT4. Более того, комбинация MeAIB и аргинина была более сильной, чем только MeAIB.ГАМК не ингибирует транспорт пролина, что подтверждает отсутствие PAT1. Фракция транспорта пролина, ингибируемая лоратадином, была отнесена к B ⁰ AT2. Вместе эти переносчики объясняют захват пролина клетками U87-MG. Поскольку селективность лоратадина не была тщательно протестирована против других переносчиков, мы подтвердили вклад B ⁰ AT2 в транспорт пролина, аланина и глутамина посредством РНКи-опосредованного сайленсинга, что соответствовало эффекту лоратадина (рис.S5). Транспорт глицина также определялся SNAT1 и SNAT2, но глицин обнаруживал остаточный транспорт в отсутствие Na ⁺ , который был отнесен к LAT2. Ингибирование аргинином не было значительным, что позволяет предположить, что SNAT4 не вносит вклад в поглощение глицина. Небольшая часть транспорта глицина ингибируется ORG24453 (ref. ²⁵ ), что согласуется со слабой экспрессией белка GlyT2 (SLC6A5; фиг. S3).

Поглощение глутамата (рис. 2f) опосредовано xCT, который чувствителен к ингибированию сульфасалазином ²⁶ , и в меньшей степени EAAT1, который чувствителен к ингибированию UCPH-101 ²⁷ .Ингибирование UCPH-101 соответствовало фракции транспорта, блокированной ингибитором неспецифического переносчика возбуждающих аминокислот (EAAT) DL- трео -β-бензилоксиаспартатом ²⁸ , что позволяет предположить, что никакой другой EAAT не участвовал.

Поглощение аргинина (рис. 2g) полностью не зависело от Na ⁺ . Значительная часть транспорта аргинина ингибировалась лейцином в присутствии Na ⁺ , но не в его отсутствие, отличительной чертой y ⁺ LAT2. Этот переносчик устойчив к обработке N -этилмалеимидом (NEM), в то время как канонические переносчики катионных аминокислот CAT1 / 2 чувствительны.Из-за относительного обилия его мРНК, чувствительная к NEM часть была отнесена к CAT1. Комбинация этих переносчиков полностью объясняет поглощение аргинина.

Активность переносчика аминокислот в клетках A549

Экспрессия мРНК и белка предполагала несколько более простой набор переносчиков аминокислот в клетках A549, включая ASCT2, LAT1 / 2, y ⁺ LAT2, CAT1, xCT и SNAT1 / 2 / 5 (рис. S1). Мы использовали ту же стратегию для анализа поглощения аминокислот клеточной линией рака легкого человека A549 (рис.3). Транспорт лейцина (рис. 3а) опосредован LAT1, LAT2, y ⁺ LAT2 и SNAT2. LAT1, LAT2, ASCT2 и SNAT1 / 5 были основными переносчиками глутамина (рис. 3b) и переносчиками аланина (рис. 3c). Поглощение пролина опосредовано SNAT1 / 2/4 и ASCT1 (фиг. 3d), тогда как захват глицина опосредовано SNAT1 / 2 и ASCT2 (фиг. 3e). Транспорт глутамата полностью осуществлялся с помощью xCT (рис. 3f). Поглощение аргинина опосредовано y ⁺ LAT2 и CAT1 (рис. 3g).

Рис. 3: Дискриминация активности транспорта аминокислот в клетках карциномы легкого A549.

Транспорт [ ¹⁴ C] аминокислот показан для a лейцина (100 мкМ, 2 мин, n = 9), b глутамина (100 мкМ, 2 мин, n = 9 ), c аланин (300 мкМ, 2 мин, n = 9), d пролин (100 мкМ, 6 мин, n = 9), e глицин (100 мкМ, 6 мин, n = 9), f глутамата (100 мкМ, 6 мин, n = 9) и г аргинина (100 мкМ, 6 мин, n = 9). Поглощение AA измеряли в буфере на основе Na ⁺ (белые квадраты над столбиками), буфере на основе NMDG ⁺ (черные квадраты над столбцами) или буфере на основе Li ⁺ (серые квадраты над столбцами). . В контрольных экспериментах ни ингибитор, ни конкурент не добавляли. За исключением NEM (10 мин преинкубации), ингибиторы и конкуренты добавляли вместе с субстратом в концентрациях, приведенных в таблице S1. Для облегчения анализа заблокированные транспортеры, относящиеся к клеточной линии, показаны над столбцами, а активные транспортеры показаны внутри столбца.Транспортеры имеют цветовую маркировку, белые пробелы указывают на неразрешенное несоответствие. Неспецифическое поглощение / связывание оценивали добавлением 10 мМ немеченого субстрата и вычитали из всех экспериментов. Для всех данных показаны среднее значение и 95% доверительный интервал. Все образцы были получены из и = 3 эксперимента. Односторонний дисперсионный анализ ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки был использован для анализа различий между группами. Группам, которые не считались отличными друг от друга, была присвоена одна и та же буква, значения p для всех сравнений перечислены в таблице S15.Аминокислоты показаны трехбуквенным кодом; BCH 2-амино-2-норборнанкарбоновая кислота, DHK дигидрокаинат, JPH JPh303, Lora, лоратадин, MeAIB N -метиламиноизомасляная кислота, NEM N -этилмалеимид, Org ORG25543, SAS сульфасалазин- трео -β-бензилоксиаспартат, UCPH UCPH-101.

Обзор активности переносчиков

На рис. 4 представлена ​​сводка распределения каждого переносчика по потокам аминокислот в клетках U87-MG (рис. 4a, b) и в клетках A549 (рис.4в, г). Данные подтверждают доминирование антипортеров LAT1 для лейцина, ASCT2 для глутамина и аланина и xCT для глутамата. Примечательно, что захват через xCT представляет собой непродуктивный обмен глутамата / глутамата, поскольку цистин восстанавливается до цистеина в цитозоле, оставляя только глутамат в качестве субстрата обмена.

Рис. 4: Деконволюция транспорта аминокислот плазматической мембраны.

Данные рис. 1 и 2 были объединены, чтобы проиллюстрировать вклад отдельных переносчиков в поглощение указанной аминокислоты.Показаны a , b активности транспорта AA в клетках U87-MG, c , d показаны в клетках A549. a , c показаны транспортеры большой вместимости, показаны b , d транспортеры малой вместимости. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, количество биологически независимых образцов такое же, как указано на рис. 2 и 3. Для сравнения активности поглощения различных аминокислот, поглощение измеряли при 100 мкМ в клетках U87-MG ( e , n = 9 биологически независимых образцов из e = 3 независимых эксперимента) и Клетки A549 ( f , n = 9 биологически независимых образцов из e = 3 независимых эксперимента).Для каждого столбца показаны 95% доверительные интервалы. Цветовая кодировка всех транспортеров указана в легенде рядом с панелями.

В обеих клеточных линиях транспорт глутамина, аланина и лейцина был намного быстрее, чем транспорт аргинина, пролина и глутамата, при измерении в концентрации 100 мкМ (рис. 4e, f). Транспорт аспартата был едва обнаружен, что подтверждает очень низкие уровни EAAT. Этот набор данных послужил основой для моделирования клеточного переноса аминокислот на системном уровне, чтобы понять их роль в гомеостазе аминокислот.

Вычислительное моделирование клеточного транспорта аминокислот

Аминокислотный транспорт может быть описан с помощью кинетики Михаэлиса-Ментен после включения электрохимических движущих сил. В результате моделирование транспортера должно соответствовать кинетическим и термодинамическим принципам. Транспортный механизм для каждого известного переносчика аминокислот показан в таблице S2. Перечень значений K _M переносчиков аминокислот человека показан в таблице S3. Эти значения K _M и значения V _max , полученные в результате транспортного анализа, были использованы для моделирования транспорта аминокислот в клетках млекопитающих с использованием ряда установленных принципов:

1. (1)

   Насыщение переносчика каждой из его субстратных аминокислот (AA _i ) следует простому алгоритму связывания:

   $$ {{{{{\ mathrm {Saturation}}}}}}} = [{{{ {{\ mathrm {AA}}}}}} _ {i}] / \ big ({K} _ {{{{{{\ mathrm {{M}}}}}}} + \ left [{{{{ {{{\ mathrm {AA}}}}}}}} _ {i} \ right] \ big) $$

   (1)

2. (2)

   Конкуренция между субстратами учитывается путем расчета очевидного K _M для аминокислоты ( i ), конкурирующей с другими аминокислотными ( a ) субстратами переносчика:

   $$ {K} _ {{ {{{\ mathrm {apps}}}}}, i} = {K} _ {{{{{{\ mathrm {M}}}}} {i}} \ Big (1+ \ sum \ frac {{{ {{{\ mathrm {AA}}}}}} _ {a}} {{K} _ {{{{{{\ mathrm {M}}}}} {a}}} \ Big) $$

   (2)

3. (3)

   Относительное насыщение рассчитывается для каждой аминокислоты (AA _i ) с использованием ее кажущейся K _M . {\ big (- \ frac {{zF} 0,5 \ треугольник \ psi} {{RT}} \ big)} $$

   (4)

   , когда транслокация благоприятствует мембранному потенциалу и делится на β , когда транслокация происходит против мембранного потенциала.

   Используя эти принципы, мы разработали систему уравнений для любого вида транспортного процесса (Список S4). К входным параметрам применяются несколько условий, чтобы избежать нарушения второго закона термодинамики при моделировании.

   1. (1)

      Все транспортеры: одинаковое расчетное значение V _max применяется к прямому и обратному потоку.

   2. (2)

      Uniporter: внеклеточные и внутриклеточные значения K _M должны быть одинаковыми, чтобы избежать накопления без градиента субстрата.

   3. (3)

      Symporter: внеклеточные и внутриклеточные значения K _M должны быть равны, чтобы избежать накопления субстрата, когда мембранный потенциал равен 0 и градиент субстрата не применяется.Более того, β (и 1/ β ) должно уменьшаться по мере увеличения концентрации субстрата на противоположной стороне, потому что переносчик будет все больше работать в режиме электронейтрального обмена. Это достигается умножением β (или 1/ β ) на долю транспортеров, которые могут выполнять чистую транспортировку. Любой симпортер не должен превышать термодинамические пределы накопления, как показано в Таблице S5.

   Применяя эти правила, мы разработали вычислительную модель, которая была реализована в MATLAB (далее называемая JDFC) и использует следующие входные данные:

   1. (1)

      K _M -значения для каждого субстрата каждого экспрессированного переносчика (таблица S3). Отсутствующие значения K _M были оценены (оценены).

   2. (2)

      Расчетные значения V _max , полученные в результате экспериментов, описанных выше (Таблица S6).

   3. (3)

      Концентрации внеклеточных аминокислот фиксировали в соответствии с рецептурой среды.

   4. (4)

      Начальные внутриклеточные концентрации аминокислот были переменными, но основывались на реальных измерениях. Равновесие не зависит от начальных концентраций.

   5. (5)

      Объем клеток, определенный анализом счетчика Коултера (рис. S6). Никакой поправки на органелларное пространство не делали, которое составляет <10% об. / Об. В клетках A549 ³⁰ .

   6. (6)

      Необязательно: фракционное преобразование одной аминокислоты в другую (например, глутамин в глутамат).

   7. (7)

      Необязательно: частичное истощение аминокислот (метаболизм или синтез белка).

   8. (8)

      Временной шаг, используемый для цикла алгоритма.

   9. (9)

      Общее количество итераций.

   JDFC использует набор функций для каждого типа транспортера (Таблица S2 / Список S4). После компиляции всех функций для набора транспортеров в клеточной линии JDFC вычисляет фракционное насыщение каждого субстрата для каждого транспортера. Соответствующая часть общего потока распределяется на каждую аминокислоту. Для каждой аминокислоты субстрата был рассчитан небольшой поток для каждого участвующего переносчика за временной шаг. Затем эти значения делятся на объем клетки для получения дополнительных изменений концентраций АК, которые суммируются для всех аминокислот. Рабочий процесс программы показан на рис.5а. Включение аминокислот в белок было намного меньше, чем при активном транспорте. Лейцин, наиболее часто кодируемая аминокислота, встраивался со скоростью 0–0,4 нмоль / мг белка за 2 мин в среду BME в клетки A549 по сравнению со скоростью переноса 40 нмоль за 2 мин (рис. S7a), в то время как его включение в клеточный белок U87-MG было ниже значимого (рис. S7b). В результате мы проигнорировали это незначительное влияние на гомеостаз аминокислот. Мы предположили, что эта система по своей природе устойчива и приходит в точку равновесия, являющуюся условием гомеостатического процесса. Это действительно так, и пример показан на рис. S7c. Двумя исключениями были глутамат и аспартат в присутствии активного EAAT. Эти переносчики теоретически могут накапливать> 100 мкМ внутриклеточного глутамата при концентрациях в плазме (таблица S5). Чтобы избежать осмотического стресса, обе клеточные линии имели минимальную активность EAAT или не имели ее (захват аспартата на фиг. 4e, f). Вместо этого глутамат генерировался метаболическим превращением глутамина, которое мы количественно оценили с использованием [ ¹³ C] глутамина. В клетках U87-MG внутриклеточный глутамин был помечен на 90% через 30 мин и> 95% в течение часа (рис.5b), что соответствует быстрой транспортировке и обмену. Цитозольный глутамат был мечен на 30% в течение 30 минут, увеличиваясь до 55% в течение 2 часов (рис. 5b). Таким образом, значительное производство глутамата происходит метаболически. В соответствии с функциональным путем глутаминолиза, глутамат метаболизируется через часть цикла TCA с образованием аспартата. Из исходного глутамина 20% превращалось в аспартат за 24 часа. Поддержание уровней аспартата и глутамата за счет метаболического превращения было дополнительно проиллюстрировано с использованием CB-839 ³¹ для ингибирования глутаминазы в клетках A549 (рис.5в). Это привело к снижению уровня глутамата на 44% и аспартата на 64% в течение 1 часа, в то время как уровень глутамина увеличился на 30%. В результате мы включили преобразование глутамина в глутамат в наше моделирование со скоростью, указанной в таблице S6. Мы также предположили, что цистин количественно превращается в два цистеина, попав в цитозоль. Это генерирует чистый отток глутамата через xCT в обмен на цистин, что было воспроизведено при моделировании. Важно отметить, что наше моделирование идентифицировало второй путь оттока глутамата через ASCT2.Путь оттока глутамата, отличный от xCT, был недавно предсказан на основе моделирования метаболизма глутамина в раковых клетках ³² . Хотя сродство ASCT2 к глутамату очень низкое, он становится измеримым субстратом при концентрациях глутамата в цитозоле 8-15 мМ. Чтобы подтвердить этот вывод из нашего моделирования, мы экспрессировали ASCT2 вместе с транспортером глутамата EAAT1 в ооцитах Xenopus laevis . Это позволило предварительно загрузить [ ¹⁴ C] глутамат в ооциты ³³ .Затем к транспортному буферу добавляли 0,5 мМ глутамина и ингибитор EAAT1 UCPH-101 для мониторинга оттока глутамата через ASCT2. В соответствии с моделированием мы обнаружили небольшое, но значительное высвобождение глутамата из ооцитов (рис. 5d), которое не могло быть опосредовано EAAT1 из-за UCPH-101. Оба транспортера активно экспрессировались, как оценивали в отдельных экспериментах по поглощению (фиг. S7d). Использование ASCT2 в качестве пути оттока глутамата было подтверждено в культуре клеток (рис. 5e). Чтобы различить возможные пути оттока, мы использовали ингибитор xCT эрастин и ингибитор ASCT2 γ-глутамил- p -нитроанилид (GPNA) и измерили внешний вид [ ¹³ C] глутамата, полученного из [ ¹³ C] глутамина в супернатант.Большая часть оттока подавлялась ингибированием xCT, а меньшая фракция — GPNA в клетках U87-MG (фиг. 5e) и A549 (фиг. S7e). Комбинированное ингибирование почти полностью подавляло отток глутамата.

   Рис. 5: Компьютерное моделирование транспорта аминокислот и метаболомики.

   a Основные этапы процесса моделирования транспорта. Подробности см. В тексте. b Мечение промежуточных продуктов метаболизма после инкубации клеток U87-MG с [ ¹³ C] глутамином (1 мМ, 100% -ная метка).Обогащение метаболитов [ ¹³ C] показано через 20, 60, 120 минут и 24 часа ( n = 3, e = 3). c Концентрации цитозольных аминокислот определяли с помощью ЖХ-МС в клетках A549. Глутаминаза ингибировалась инкубацией с CB-839 (10 мкМ, 1 час) и уровнями аминокислот по сравнению с контролем ( n = 15, e = 3). d Ооциты, экспрессирующие ASCT2 и EAAT1, предварительно загружали 100 мкМ [ ¹⁴ C] глутамата в течение 1 часа. После промывки отток был инициирован добавлением 0.5 мМ глутамина (зеленые столбцы) в буфере для инкубации ооцитов. Контроли остались без добавления (оранжевые полосы). Повторный захват глутамата ингибировался ингибитором транспорта глутамата UCPH-101 ( n = 10, e = 3). e Отток глутамата в клетки A549 измеряли путем кормления клеток [ ¹³ C] глутамина в среде BME с добавлением заменимых аминокислот и обнаружения глутамата M + 5 в среде с течением времени ( n = 3, e = 3).Чтобы различать пути оттока глутамата, использовали ингибитор xCT эрастин и ингибитор ASCT2 GPNA. Данные представлены как среднее значение ± 95% доверительный интервал.

   Сравнение данных in silico с данными in vitro

   Ввиду устойчивого равновесия, достигнутого при моделировании, мы задались вопросом, будет ли это точно отражено in vitro. Таким образом, мы сравнили смоделированные и экспериментальные внутриклеточные концентрации аминокислот в клетках A549 (рис. 6a) и U87-MG (рис. 6b). Оба набора данных хорошо согласуются с экспериментальными значениями, что оценивается графиком корреляции между экспериментальными и прогнозируемыми значениями, что дает коэффициент корреляции Пирсона, равный 0.9996 для клеток A549 и 0,9588 для клеток U87-MG (рис. S8a, b) в диапазоне концентраций от 100 до 16000 мкМ.

   Рис. 6: Сравнение in silico и экспериментальных данных в клеточных линиях.

   a , b Концентрации цитозольных аминокислот определяли с помощью ЖХ-МС и сравнивали с смоделированными (JDFC) концентрациями аминокислот в клетках A549 ( a , n = 15, e = 3) и Ячейки U87-MG ( b , n = 15, e = 3).Клетки инкубировали в среде BME с заменителями аминокислот в течение 30 мин перед анализом. c , d Клетки U87-MG инкубировали со смесью всех протеиногенных аминокислот (по 100 мкМ каждая). Затем в указанную аминокислоту добавляли концентрацию 500 мкМ ( n = 15, e = 3). Концентрации цитозольных аминокислот определяли с помощью ЖХ-МС в клетках U87-MG ( c ) и моделировали с использованием JDFC ( d ). e — г Клетки A549 предварительно инкубировали в течение 30 мин со смесью всех протеиногенных аминокислот (100 мкМ каждая).Затем добавляли шесть аминокислот (красные символы) в концентрации 500 мкМ. Концентрации цитозольных аминокислот определяли с помощью ЖХ-МС перед добавлением смесей аминокислот и через 15 ( e ), 30 ( f ) и 60 ( г ) минут ( n = 15, e ). = 3). Корреляция между экспериментальными данными и моделированием была проанализирована с использованием квадрантной диаграммы, отображающей изменение журнала ₂ для каждой временной точки. h Схема, иллюстрирующая третичный активный транспорт и действие ингибиторов транспорта аминокислот MeAIB и JPh303.Симпортеры окрашены в зеленый цвет, антипортеры — в синий. i Клетки инкубировали в течение 30 минут в BME плюс заменимые аминокислоты в отсутствие (контроль) и в присутствии ингибитора LAT1 JPh303 и ингибитора SNAT1 / 2 MeAIB. Аминокислоты измеряли с помощью ЖХ-МС через 30 мин ( n = 15, e = 3). Экспериментальные данные представлены в виде среднего ± 95% доверительного интервала (, — c ) или в виде графика с усами ( и ), показывающего диапазон, площадь 25–75%, медианное и среднее значение.

   Наделение клеток смесью симпортеров, антипортеров и унипортеров связывает различные пулы аминокислот. Таким образом, мы проверили, как концентрации аминокислот будут реагировать на пятикратный выброс одной аминокислоты. С этой целью мы уравновешивали клетки U87-MG в среде, содержащей все аминокислоты в концентрации 100 мкМ, и добавляли специфические аминокислоты до 500 мкМ. Интересно, что пиковый эффект затронул в основном выбранную аминокислоту (рис. 6c). При моделировании эксперимент был полностью воспроизведен (рис.6d), что дает коэффициент корреляции Пирсона ( R ) 0,968. Уровни глутамата модулировались добавлением аминокислот, но не было явного скачка цитозольного глутамата при увеличении внеклеточной концентрации самого глутамата, что соответствовало низким уровням чистого транспорта.

   Для дальнейшего анализа реакции моделирования на изменения внеклеточных аминокислот мы добавили смесь из шести аминокислот и проследили за изменениями аминокислот в течение 1 часа в клетках A549 (рис. 6e – g). Чтобы оценить соответствие моделирования, мы использовали график квадрантов журнала ₂ (± переназначен после преобразования журнала) измеренных ( y -ось) и смоделированных изменений ( x -ось).Добавленные аминокислоты находились в верхнем правом квадранте, что указывает на увеличение цитозольных концентраций (красные точки), в то время как аминокислоты без добавок служили субстратами оттока и заканчивались в нижнем левом квадранте (черные точки). Моделирование и экспериментальные данные показали сильную корреляцию R = 0,99, 0,94 и 0,92 при t = 0,25 часа (рис. 6e), 0,5 часа (рис. 6f) и 1 час (рис. 6g), соответственно. В клетках U87-MG экспериментальные и предсказанные абсолютные концентрации аминокислот показали высокий уровень корреляции с R = 0.95, 0,92 и 0,89 при t = 0,25 ч (рис. S8c), 0,5 ч (рис. S8d) и 1h (рис. S8e) соответственно. Изменения в клетках U87-MG, проанализированные с помощью квадрантного графика, также показали сильную корреляцию между моделированием и экспериментом с R = 0,98, 0,95 и 0,97 при t = 0,25 ч (рис. S8f), 0,5 (рис. S8g). ) и 1h (рис. S8h) соответственно.

   Наша модель предсказывает, что SNAT1 / 2/4 накапливает аминокислоты в цитозоле, а импортированные аминокислоты затем используются для введения других аминокислот посредством процессов обмена, т.е.е., третичный активный транспорт (рис. 6h). Соответственно, ингибирование SNAT1 / 2/4 с помощью MeAIB привело к сильному снижению их субстратов, глутамина, треонина, метионина и серина, и меньшему снижению аланина, глицина и гистидина в клетках A549 (рис. 6i). Глутамат метаболически образовывался из глутамина и аналогично снижался в присутствии MeAIB. Более того, за счет третичного транспорта также снижались субстраты LAT1, изолейцин, лейцин, валин, фенилаланин и тирозин.Увеличение глутамина в присутствии JPh303 предполагает, что соединение блокирует его отток и что глутамин используется в качестве субстрата обмена в клетках A549. Ингибирование LAT1 с помощью JPh303 (рис. 6i) привело к более избирательному снижению валина, тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и гистидина. Похожая картина наблюдалась в клетках U87-MG (рис. S9a).

   Смеси аминокислот разрабатываются в качестве терапевтических продуктов для восстановления баланса метаболических дисфункций, таких как атрофия мышц. ³⁴ .Часто бывает трудно предсказать клеточные аминокислотные изменения после употребления аминокислотных смесей. Для полного анализа требуются данные о транспортной активности, в то время как данные об экспрессии мРНК легко доступны для многих типов клеток и тканей. Таким образом, мы исследовали, были ли данные относительной экспрессии достаточными для моделирования гомеостаза аминокислот в медицинской релевантной клеточной модели. В этом эксперименте мы использовали первичные мышечные трубки человека, которые инкубировали со смесью аминокислот, содержащей лейцин, изолейцин, валин, аргинин, глутамин, гистидин, лизин, фенилаланин, треонин и N -ацетил-цистеин, соответствующий AXA2678 (Axcella Health Inc.) для улучшения мышечной функции ³⁴ . Концентрации цитозольных аминокислот измеряли перед добавлением смеси аминокислот и в течение 120 мин (рис. 7а). Морфометрию использовали для определения объема дифференцированных мышечных трубок и для расчета внутриклеточных концентраций. На фигуре 7b показано соответствующее моделирование (исключая N, -ацетил-цистеин) с участием 25 различных переносчиков аминокислот, экспрессируемых в этих культурах. Для моделирования мы использовали транспортную активность, пропорциональную экспрессии мРНК (Таблица S6).Моделирование хорошо коррелировало с экспериментальными данными во всех временных точках, достигнув значения Пирсона R 0,97 при t = 0,25 часа (рис. 7c) и t = 2 часа (рис. 7d). Значительное увеличение наблюдалось для всех добавленных аминокислот (Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Thr и Val) в течение 15 минут в мышечных трубках и при моделировании (рис. 7e, f, R Пирсона = 0,92 / 0,93), в то время как аланин, серин и аспарагин были основными субстратами оттока. Динамика системы также хорошо воспроизводилась для сред, вызывающих воспаление в мышцах (модель саркопенической мышцы; рис.S9b). Эксперименты с миотрубками предполагают, что переходные концентрации клеточных аминокислот можно моделировать на основе изменений аминокислот в плазме и данных экспрессии мРНК. Важно отметить, что данные демонстрируют, что соотношение внеклеточных и внутриклеточных концентраций аминокислот определяется транспортными процессами.

   Рис. 7: Сравнение in silico и экспериментальных данных на мышечных трубках человека.

   Первичные миотрубки человека обрабатывали смесью аминокислот, соответствующей составляющим аминокислотам AXA2678, в течение 2 часов ( n = 3, e = 3). a Концентрации цитозольных аминокислот определяли с помощью ЖХ-МС перед добавлением смесей аминокислот и в течение 2 часов после добавления. Объем клеток определяли морфометрически. Те же начальные концентрации использовались для JDFC, и моделирование было выполнено для 3200 циклов ( b ). c , d Корреляция экспериментальных и смоделированных данных после t = 0,25 ч, R = 0,97 ( c ) и t = 2 часа, R = 0.97 ( д ). e , f Корреляционный анализ изменений с использованием квадрантной диаграммы, отображающей логарифм ₂ изменение при t = 0,25 ч, R = 0,92 ( e ) и t = 2 h, R = 0,93 ( f ). Добавленные аминокислоты показаны красными точками.

   19.3. Почтовые транспортные агенты Red Hat Enterprise Linux 6

   Red Hat Enterprise Linux предлагает два основных MTA: Postfix и Sendmail. Postfix настроен как MTA по умолчанию, хотя MTA по умолчанию легко переключить на Sendmail.Чтобы переключить MTA по умолчанию на Sendmail, вы можете удалить Postfix или использовать следующую команду для переключения на Sendmail:

   Вы также можете использовать команду в следующем формате, чтобы включить или отключить нужную службу:

   Postfix, изначально разработанный в IBM экспертом по безопасности и программистом Витсе Венемой, представляет собой совместимый с Sendmail MTA, обеспечивающий безопасность, скорость и простоту настройки.

   Для повышения безопасности Postfix использует модульную структуру, в которой небольшие процессы с ограниченными привилегиями запускаются ведущим демоном .Более мелкие, менее привилегированные процессы выполняют очень специфические задачи, связанные с различными этапами доставки почты, и запускаются в измененной корневой среде, чтобы ограничить последствия атак.

   Настройка Postfix для приема сетевых подключений от хостов, отличных от локального компьютера, требует лишь нескольких незначительных изменений в его файле конфигурации. Тем не менее, для тех, у кого более сложные потребности, Postfix предоставляет множество вариантов конфигурации, а также сторонние надстройки, которые делают его очень универсальным и полнофункциональным MTA.

   Файлы конфигурации для Postfix удобочитаемы и поддерживают до 250 директив. В отличие от Sendmail, для того, чтобы изменения вступили в силу, не требуется никакой обработки макросов, и большинство наиболее часто используемых параметров описаны в сильно комментированных файлах.

   19.3.1.1. Установка Postfix по умолчанию

   Исполняемый файл Postfix — / usr / sbin / postfix . Этот демон запускает все связанные процессы, необходимые для доставки почты.

   Postfix хранит свои файлы конфигурации в каталоге / etc / postfix / . Ниже приводится список наиболее часто используемых файлов:

   • доступ — используется для управления доступом, этот файл определяет, каким хостам разрешено подключаться к Postfix.

   • main.cf — Глобальный файл конфигурации Postfix. В этом файле указано большинство параметров конфигурации.

   • мастер.cf — Определяет, как Postfix взаимодействует с различными процессами для доставки почты.

   • транспорт — сопоставляет адреса электронной почты с узлами ретрансляции.

   Файл псевдонимов находится в каталоге / etc / . Этот файл используется Postfix и Sendmail совместно. Это настраиваемый список, необходимый для почтового протокола, который описывает псевдонимы идентификаторов пользователей.

   По умолчанию / etc / postfix / main.Файл cf не позволяет Postfix принимать сетевые подключения от хоста, отличного от локального. Инструкции по настройке Postfix в качестве сервера для других клиентов см. В Раздел 19.3.1.2, «Базовая конфигурация Postfix». Перезапустите службу postfix после изменения любых параметров в файлах конфигурации в каталоге / etc / postfix , чтобы эти изменения вступили в силу:

    ~] #  перезапуск постфикса службы  

   19.3.1.2. Базовая конфигурация Postfix

   По умолчанию Postfix не принимает сетевые подключения от любого хоста, кроме локального. Выполните следующие шаги как root , чтобы включить доставку почты для других хостов в сети:

   • Отредактируйте файл /etc/postfix/main.cf с помощью текстового редактора, например vi .

   • Раскомментируйте строку mydomain , удалив знак решетки ( # ), и замените домен .tld с доменом, который обслуживает почтовый сервер, например example.com .

   • Раскомментируйте строку myorigin = $ mydomain .

   • Раскомментируйте строку myhostname и замените host.domain.tld именем хоста для машины.

   • Раскомментируйте строку mydestination = $ myhostname, localhost. $ Mydomain .

   • Раскомментируйте строку mynetworks и замените 168.100.189.0 / 28 с допустимыми настройками сети для хостов, которые могут подключаться к серверу.

   • Раскомментируйте строку inet_interfaces = all .

   • Прокомментируйте строку inet_interfaces = localhost .

   • Перезапустите службу postfix .

   После выполнения этих шагов хост принимает внешние электронные письма для доставки.

   Postfix имеет большой набор опций конфигурации.Один из лучших способов узнать, как настроить Postfix, — это прочитать комментарии в файле конфигурации /etc/postfix/main.cf . Дополнительные ресурсы, включая информацию о конфигурации Postfix, интеграции SpamAssassin или подробные описания параметров /etc/postfix/main.cf , доступны в Интернете по адресу http://www.postfix.org/.

   19.3.1.2.1. Настройка Postfix для использования безопасности транспортного уровня

   Из-за уязвимости, описанной в разрешении для POODLE SSL 3.0 (CVE-2014-3566) в Postfix и Dovecot , Red Hat рекомендует отключить SSL , если он включен, и использовать только TLSv1.1 или TLSv1.2 . Обратной совместимости можно добиться с помощью TLSv1.0 . Многие продукты, поддерживаемые Red Hat, могут использовать протоколы SSLv2 или SSLv3 . Однако теперь настоятельно не рекомендуется использовать SSLv2 или SSLv3 .

   19.3.1.3. Использование Postfix с LDAP

   Postfix может использовать каталог LDAP в качестве источника для различных таблиц поиска (например,г .: псевдонимы , виртуальный , канонический и т. д.). Это позволяет LDAP хранить иерархическую информацию о пользователях, а Postfix получать только результат запросов LDAP , когда это необходимо. Не храня эту информацию локально, администраторы могут легко ее поддерживать.

   19.3.1.3.1. Пример поиска / etc / aliases

   Ниже приведен базовый пример использования LDAP для поиска файла / etc / aliases .Убедитесь, что ваш файл /etc/postfix/main.cf содержит следующее:

   alias_maps = хэш: / etc / aliases, ldap: /etc/postfix/ldap-aliases.cf 

   Создайте файл /etc/postfix/ldap-aliases.cf , если у вас его еще нет, и убедитесь, что он содержит следующее:

   server_host =  ldap.example.com 
   search_base = dc = , пример , dc =  com  

   где ldap.example.com , example и com — это параметры, которые необходимо заменить спецификацией существующего доступного сервера LDAP .

   Файл /etc/postfix/ldap-aliases.cf может указывать различные параметры, включая параметры, которые включают LDAP SSL и STARTTLS . Для получения дополнительной информации см. Справочную страницу ldap_table (5) .

   Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

   Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

   ---

   Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

   Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

   • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
   • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
   • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
   • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
   • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

   ---

   Почему этому сайту требуются файлы cookie?

   Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

   ---

   Что сохраняется в файле cookie?

   Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

   Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

   Транспорт и путешествия в Шотландии 2010

   Таблица S1 Сводная информация о транспорте в Шотландии

   Номера

   	2000	2001	2002	2003	2004	2005	2006	2007	2008	2009	2010
   Лицензированные автомобили											тыс.
   Частные и легкие товары 1	1 927	1,997	2,058	2 104	2 158	2,231	2,259	2,313	2,347	2,362	2,364
   Все автомобили 1	2 188	2,262	2,330	2,383	2,448	2,531	2,564	2 627	2,665	2 684	2 685
   Новые регистрации	220	241	259	262	263	251	243	251	215	216	209
   Местные автобусы2											миллионов
   Пассажирские поездки (посадки) 3	458	466	471	478	461	468	482	498	493	467	..
   Километров автомобиля3	369	368	374	369	369	382	387	390	365	379	..
   Выручка от пассажирских перевозок											млн фунтов
   по ценам последнего года3	417	395	423	415	583	613	648	662	650	626	..
   Груз снят											млн тонн
   Дорога 4	158,5	150,8	154,4	153,4	173,1	165,6	173,7	181,8	163,6	139,3	..
   Рельс 2	8,25	9,57	9,12	8,32	11,25	14,32	12,96	11,35	10,36	9,68	..
   Побережье	24,7	20,6	19,2	19,5	20,5	25,5	20.6	22,8	23,3	19,8	..
   Однопортовый трафик	1,54	1,90	1,81	1,54	1,33	1,76	1,48	1,83	1,75	3,59	..
   Внутреннее водное сообщение	12,24	11,41	10.01	10,06	9,97	10,19	10,16	10,50	12,19	10,10	..
   Трубопроводы 5	28,1	28,1	28,0	27,7	27,6	27,6	27,8	27,5	27,6	27,6	27,6
   Протяженность дорог общего пользования 6											километров
   Багажник (A и M)	3 488	3 488	3 488	3 432	3 432	3 432	3 405	3 405	3 405	3 405	3 405
   Прочие основные (A и M)	7 414	7,407	7 417	7 418	7 418	7 433	7,424	7 381	7 421	7 421	7 423
   Второстепенные дороги	42 984	43 159	43 687	43 659	43 693	43 911	44029	44 303	44 420	44 594	44 675
   Все дороги	53 886	54054	54 592	54 509	54 543	54 776	54 858	55 089	55 246	55 420	55 503
   Дорожное движение											млн транспортно-километров
   Автомагистрали	5 405	5,567	5 730	5 856	6 094	6 151	6 433	6 577	6 683	6 633	6 503
   Дороги А	20 531	20 775	21 533	21 826	22 114	21 904	22 465	22 408	22 127	22 327	21 992
   Все дороги (вкл.B, C, без)	39 561	40 065	41 535	42 038	42 705	42 718	44,119	44 666	44 470	44 219	43 488
   Зарегистрированные несчастные случаи в ДТП
   Убито	326	348	304	336	308	286	314	281	270	216	208
   Убитые и серьезные	3 894	3,758	3,533	3 294	3 074	2 952	2 949	2,666	2 844	2 502	2 168
   Все (убиты, серьезные, незначительные)	20 517	19 911	19 275	18 757	18 502	17 885	17 269	16 238	15,590	15 043	13 324
   Рельс пассажирский 2,7											миллионов
   Пассажирские перевозки ScotRail7	63.16	60,75	57,38	57,45	64,02	69,43	71,59	74,47	76,43	76,93	78,29
   Данные ORR:
   Железнодорожные перевозки в / из Шотландии 8	64.8	64,6	61,4	66,1	72,9	78,1	79,5	87,7	84,3	85,2	..
   Пассажирские квитанции (млн фунтов стерлингов 2009 г.)	231,2	238,4	233,8	246,1	260,7	261,6	269,4	306,7	319.0	336,5	..
   Воздушный транспорт											тыс.
   Пассажиры терминала	16 787	18 081	19 783	21 084	22 555	23 795	24 437	25 132	24 348	22 496	20 907
   Транспортные перевозки	333.5	360,6	362,6	367,3	385,6	408,8	420,6	428,2	417,1	382,7	354,4
   											тыс. Тонн
   Грузовые перевозки	74,6	72.4	72,6	76,5	77,6	74,5	77,9	61,2	45,6	45,7	41,6
   Паромы (отдельные услуги9)											тыс.
   Пассажиры	5,294	5,304	5,365	5 721	5 921	5 971	6 020	6 012	5 699	5 935	5 872
   Транспортные средства	1,171	1,211	1,241	1,260	1,338	1,365	1,372	1,416	1,377	1,445	1,408

   1 DfT пересмотрел данные для легких грузов и типов кузовов с 2001 года.DfT не имеет базовых данных, чтобы пересмотреть данные за предыдущие годы.

   2 финансовых года

   3 DfT пересмотрел цифры, начиная с 2004/05 г., в результате методологических усовершенствований. Цифры до этого периода напрямую не сопоставимы.
   См. Главу 2 для более подробной информации.

   4 Груз, перевозимый в Шотландии зарегистрированными в Великобритании перевозчиками, независимо от того, находится ли пункт назначения в Шотландии, в другом месте Великобритании или за пределами Великобритании.
   Цифры за 2004 г. и далее несовместимы с данными за предыдущие годы из-за изменений в методологии и системе обработки обследования.

   5 Расчетное количество сырой нефти и нефтепродуктов, перевозимых по трубопроводам протяженностью более 50 км. Показатель 2010 г. оценен.

   6 Данные предварительные. Некоторые данные за 2009 год были использованы для расчета протяженности дорог за 2010 год, когда эта информация недоступна для некоторых местных властей.

   7 ScotRail представил новую методологию, которая лучше оценивает поездки Strathclyde Zonecard с 2009/10. Цифры, начиная с 2003/04 г. и далее
   , представляют влияние этого на ранее представленные данные, чтобы обеспечить более значимое сравнение года с годом.Обратите внимание, что это никак не повлияет на фактически совершенные
   поездки. Более подробную информацию об этом можно найти в параграфах 4.3 и далее.

   8 Управление железнодорожного регулирования (ORR) производит общие данные о пассажирах. Они не скорректированы для отражения пересмотренной методологии ScotRail и, следовательно,
   не сопоставимы с цифрами ScotRail.

   9 Те услуги, данные по которым (по крайней мере) доступны с 1975 года: Caledonian MacBrayne, P&O Scottish Ferries / NorthLink Orkney & Shetland и Orkney Ferries.

   SEC.gov | Превышен порог скорости запросов

   Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

   Пожалуйста, объявите свой трафик, обновив свой пользовательский агент, чтобы включить в него информацию о компании.

   Чтобы узнать о передовых методах эффективной загрузки информации с SEC.gov, в том числе о последних документах EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценарию. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу [email protected].

   Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC.Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

   Код ссылки: 0.7ecef50.1633617139.571bc98

   Дополнительная информация

   Политика безопасности в Интернете

   Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и для обеспечения того, чтобы общедоступная услуга оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

   Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 USC §§ 1001 и 1030).

   Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других пользователей к SEC.содержание правительства. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерное количество запросов. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

   Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период. Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.губ. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

   Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

   No related posts.