Проверить подлинность осаго: Проверить ОСАГО по номеру страхового полиса на подлинность 🔺 Проверка страховки

Как проверить полис ОСАГО на подлинность?

К сожалению, проблема поддельных полисов ОСАГО не утратила актуальность даже после введения электронной автогражданки, когда для покупки полиса владельцу транспортного средства достаточно посетить сайт нужной страховой компании.

Типы проверки полиса обязательного автострахования на подлинность зависят от того, где именно автовладелец решил купить страховку: у агента, в офисе страховой компании или на её сайте. Сегодня собственники транспорта с разной долей вероятности рискуют нарваться на поддельный полис ОСАГО в любой из приведенных ситуаций.

Чтобы обезопасить себя от неприятностей в случае дорожной аварии и не потратить деньги напрасно, нужно знать, как именно мошенники проворачивают аферы с поддельными полисами обязательного автострахования.

Покупка страховки через посредника

Приобретение полиса обязательного автострахования через посредника всегда связано с риском получения подделки, причем это справедливо как в случае с агентами-частными лицами, так и в случае с различными фирмами, представляющими интересы одной или нескольких страховых компаний.

Первым этапом в общении с посредником всегда должна быть проверка его полномочий.

Страховые компании обязаны размещать на своих официальных сайтах реестры агентов. Обратившись к такому реестру, можно выяснить, имеются ли у посредника достаточные полномочия для оформления автогражданки в конкретной компании.

Кроме того, посредники всегда работают через агентские договоры. Не будет лишним попросить агента предъявить такой договор, а заодно и доверенность от страховой компании на право оформления полисов ОСАГО.

Даже в случае, когда упомянутые документы имеются, стоит проверить на подлинность и сам бланк страхового полиса. Сначала через запрос на официальном сайте РСА проверяется принадлежность бланка конкретной компании. Затем нужно удостовериться в подлинности бланка: нередко мошенники дублируют номера реально существующих документов.

Полис ОСАГО имеет несколько степеней защиты, в частности видные на просвет водяные знаки и вшитую в бумагу металлическую ленту.

Если полномочия посредника подтверждены, а бланк полиса не вызывает сомнений, то нужно обратить внимание всего на один важный момент – цену страховки. Чересчур низкая цена – признак того, что автовладельцу пытаются продать подделку.

После приобретения полиса, примерно через неделю, желательно позвонить в страховую компанию, чтобы убедиться, что посредник передал автостраховщику деньги и второй экземпляр полиса ОСАГО.

Покупка полиса в офисе страховой компании

Оформление страховки в одном из офисов страховой компании не гарантирует собственнику транспортного средства стопроцентную защиту от подделки. Аферисты попадаются и среди менеджеров, что подтверждается многочисленными новостями в средствах массовой информации.

Принцип проверки полиса при покупке в офисе автостраховщика тот же, что и при оформлении страховки через посредника. Сначала нужно удостовериться в полномочиях сотрудника, подписавшего бланк полиса. Для этого достаточно попросить у него доверенность на право оформления полисов ОСАГО. Затем стоит при возможности проверить бланк по базе РСА.

Если в графе «Статус полиса» фразы «Утрачен» или «Находится у страхователя», то перед автовладельцем поддельный или краденый бланк.

От покупки такой страховки стоит отказаться. При этом желательно найти время на звонок в контактный центр страховой компании, чтобы сообщить о выявленной подделке и сотруднике, который пытался её сбыть. Служба безопасности страховщика непременно примет меры в отношении неблагонадежного менеджера.

Покупка полиса на сайте страховой компании

С одной стороны, покупка электронной автогражданки гарантировано защищает автовладельца от риска покупки подделки, но случается, что аферисты подделывают сами сайты страховых компаний. Для защиты собственников транспорта Центробанк и Яндекс ввели систему маркировки сайтов компаний, имеющих лицензию на оказание страховых услуг.

В поисковой выдаче Яндекса такие сайты помечены зеленым маркером с надписью «Реестр ЦБ РФ».

Можно смело переходить по ссылке с такой маркировкой – это подлинный официальный сайт страховой компании, а не подделка. Сайты же без маркировки, скорее всего, созданы аферистами с целью обмана автовладельцев. Хотя бывают и исключения – сайты разнообразных страховых агентов опять же часто сделаны в стиле официальных порталов страховщиков, но на таких площадках нет возможности оформить онлайн-ОСАГО.

К исключениям же относятся крупные сайты-агрегаторы, позволяющие рассчитать цену полиса одновременно в нескольких компаниях и оформить страховку в понравившейся.

Отдельного внимания заслуживают посредники, которые обещают оформить электронную автогражданку за автовладельца. Эта услуга востребована, так как не все собственники транспорта в достаточной степени умеют пользоваться компьютером.

К таким посредникам лучше не обращаться, ведь весьма часто они проворачивают простую аферу прямо под носом у клиента. Например, при оформлении электронной автостраховки указывается регион с низким территориальным коэффициентом, ниже того, который был бы применен при указании реального места проживания собственника транспортного средства.

В результате полис становится гораздо дешевле, но не для автовладельца, ему страховку продают по реальной цене.

Разницу же посредник присваивает себе. По итогу выходит, что владелец машины указал при оформлении полиса недостоверные сведения, о чем сам даже не подозревает.

Если этот факт будет выявлен при внесении изменений в страховку или при ее пролонгации, то последствия не столь печальны: страховая компания потребует у клиента доплатить необходимую сумму. А вот если факт обмана вскроется после ДТП по вине водителя, вписанного в такой полис, ему точно предъявят регрессное требование.

Иначе говоря, страховая компания попросит водителя-виновника аварии вернуть ей деньги, затраченные на возмещение причиненного им ущерба.

Электронное ОСАГО признали не все сотрудники ГИБДД

Не все сотрудники ГИБДД оказались в курсе введения электронных полисов ОСАГО: некоторые налагают на автовладельцев с распечатанными е-полисами штрафы за отсутствие полиса, рассказал президент Российского союза автостраховщиков (РСА) Игорь Юргенс.

Руководство МВД дало официальные разъяснения о равном хождении обоих видов полисов, но есть инспекторы, которые, умышленно или неумышленно, не просто не признают скан документом, но и штрафуют водителей за отсутствие полиса — когда он есть, но электронный, рассказывает Юргенс.

«Мы действительно получаем жалобы от граждан, возмущенных тем, что полицейские останавливают их и требуют бланк полиса на бумаге», — рассказывает заместитель исполнительного директора РСА Сергей Ефремов. По его словам, единичные жалобы стали поступать еще в 2015 г., когда автовладельцы получили возможность покупать е-ОСАГО. С введением обязательных электронных продаж с 1 января 2017 г. доля электронных договоров существенно выросла: за месяц продано 200 000 е-полисов, тогда как за весь прошлый год — 330 000. Но участились и штрафы за отсутствие полиса при заключенном е-ОСАГО: сейчас их счет по всей России идет на сотни, замечает Ефремов. В ЦБ подобные жалобы не поступали, утверждает его представитель.

В июле 2015 г. МВД сообщило РСА, что сотрудникам ГИБДД предписано проверять электронные полисы ОСАГО при помощи сети ИМТС МВД России или официального сайта РСА («Ведомости» ознакомились с предоставленными разъяснениями, представитель союза подтвердил их подлинность). Разъяснения даны, но никто не отменял правил дорожного движения, которым должен руководствоваться инспектор ДПС, говорит Ефремов: водитель обязан иметь при себе водительское удостоверение, свидетельство о регистрации и страховой полис ОСАГО, а вот какой — бумажный или электронный — не уточняется. Чаще всего проблемы возникают, когда у работника ГИБДД нет смартфона или планшета, который позволил бы ему проверить подлинность полиса в базе РСА, продолжает он. По словам Ефремова, сейчас союз и ЦБ обратились с запросами в ГИБДД — возможно, коллизия с е-полисом в итоге будет разрешена.

Случаи штрафов есть даже в Москве — но это, по всей видимости, водители даже без распечатанного полиса, добавляет Ефремов: «Мы предлагаем гражданам при оформлении электронного полиса распечатать его или запросить страховую компанию, и она вышлет распечатанный полис с печатью и подписью — это будет основанием, что полис оформлен, просто в электронном виде».

В соответствии с законом об ОСАГО водитель автомобиля обязан иметь при себе полис автогражданки или распечатанную на бумаге информацию о заключении договора е-ОСАГО и предъявлять его для проверки сотрудникам полиции, разъясняет представитель МВД. Если сведения о нем в информационной системе РСА отсутствуют, водитель будет оштрафован. Но действия инспектора ДПС, если гражданин с ними не согласен, можно обжаловать, напоминает представитель МВД: при выявлении нарушений тот будет привлечен к ответственности в соответствии с законом.

Проверка подлинности полиса ОСАГО

Мошенники не упускают ни одной возможности поживиться на потребностях обычных автовладельцев. Особенно часто последние сталкиваются с мошенничеством во время приобретения страховых полисов: после покупки страховки оказывается, что она недействительна, а значит, владельцу авто приходится полностью компенсировать ущерб в случае ДТП. Сегодня мы поговорим о том,как проверить страховой полис ОСАГО на подлинность и какие меры необходимо принимать в случае выявления обмана.

Как визуально определить подлинность страхового полиса

Проверка полиса ОСАГО на подлинность – это не такая уж и сложная задача, если знать все особенности этого документа. И в первую очередь необходимо обращать внимание на то, как выглядит документ, за который вы платите деньги. Стоит понимать, что в каждой стране имеется унифицированный стандарт внешнего вида страхового полиса ОСАГО, и если предоставленная страховой компанией «бумажка» не совпадает с ней – у вас в руках подделка.

Итак, какими особенностями отличается оригинальный полис ОСАГО:

• Полис печатается на стандартном бланке, размеры которого являются практически идентичными размерам листа бумаги формата А4. Лишь по длине страховой полис немного больше – примерно на 1 сантиметр.

• Вся лицевая сторона бланка полиса имеет фон, представленный в виде микросетки, выполненной в зеленовато-голубых тонах. Помимо этого, по всему бланку можно невооруженным взглядом рассмотреть ворсинки красного цвета, которые наносятся на него во время изготовления.

• Обратная сторона полиса отличается наличием металлической полоски, ширина которой примерно 2 мм. Располагается она справой стороны.

• На полисе также обязательно должна просматриваться эмблема РСА.

• Печать полисов ОСАГО выполняется только качественной краской, которая при контакте с руками и другими предметами не отпечатывается.

• В верхнем правом углу документа обязательно указывается 10-значный номер. Он должен ощущаться при прикосновении к нему.

С 1 апреля 2015 года в России принята новая серия номеров полисов ОСАГО, которая указывается буквами ЕЕЕ. Применение на бланках любой другой серии является невозможным, так как это делает их недействительными.

Важно! Если речь идет об электронных полисах ОСАГО, купленных через Интернет, то они имеют свою отличительную серию – «ХХХ».

Однакопроверка подлинности полиса ОСАГО не ограничивается только его внешним осмотром. Дабы убедиться в том, что вас не обманули, необходимо также внимательно выбирать страховую компанию, которая предоставляет подобные документы автовладельцам.

Проверяем полномочия компании-страховика

Дабы не приходилось осуществлять проверку полиса ОСАГО на подлинность, перед его оформлением стоит поинтересоваться компанией, в которой вы собираетесь получать страховку.

Первым делом убедитесь в наличии у вашего страховика лицензии, позволяющей осуществлять реализацию полисов ОСАГО. Стоит также учесть, что для убедительности мошенники могут использовать приостановленные или же отозванные лицензии, по этой причине всегда просите предоставить вам оригинал этого документа.

Что же касается ситуации, когда не вы сами обращаетесь в страховую фирму, а вам предлагает приобрести полис страховой агент, также следует обязательно удостовериться в том, что этот агент является действительным представителем компании. В частности, у него обязательно должна быть доверенность, подтверждающая его право на заключение договоров непосредственно о страховании автомобилей.

Очень важно, чтобы упомянутая доверенность содержала в себе следующие пункты:

1. Название страховой компании, которую представляет агент (обязательно убедитесь, что она существует).

2. Период действия данной доверенности.

3. Паспортные данные агента, с которым вы собираетесь подписать договор о страховании.

4. Перечень страховых договоров, которые может заключать страховой агент (в нем обязательно должен значиться полис ОСАГО).

Как проверить подлинность полиса ОСАГО по его регистрационному номеру

Чтобы проверить полис ОСАГО на подлинность в РСА, потребуется всего лишь несколько минут вашего времени и точка доступа к всемирной паутине. Дело в том, что сразу после заключения договора о страховании ОСАГО его регистрационный номер и дата подписания в обязательном порядке вносятся в единую базу РСА. При этом не имеет значения, как вы покупаете полис – непосредственно у страховой компании, через официального посредника или же на сайте РСА в электронном виде.

Чтобы узнать, является ли действительным ваш полис, вам всего лишь необходимо перейти на официальный сайт РСА и осуществить по нему следующий путь:

1. Перейти в раздел «ОСАГО».

2. Слева выбрать раздел «Сведения для страхователей и потерпевших».

3. В появившемся синем списке выбрать первую позицию «Сведения для страхователей о статусе бланка ОСАГО и дате заключения договора».

4. Вы автоматически будете переведены на страницу, где вам необходимо будет указать отдельно серию бланка полиса ОСАГО, и отдельно его регистрационный номер.

Во время проверки подлинности полиса ОСАГО на сайте РСА система также потребует от вас ввести в специальное окошко капчу, чтобы убедиться в том, что вы являетесь человеком, а не роботом. Это является обязательной процедурой.

Если номер вашего полиса действительно есть в базе – на экране своего компьютера вы сможете увидеть о нем информацию. Если же его нет, система даст неудовлетворительный результат поиска. Это будет означать, что у вас в руках находится недействительный страховой полис ОСАГО.

Важно! Все эти же указания помогут проверить также и подлинность электронного полиса ОСАГО.

О чем стоит знать, чтобы не купить поддельный полис

На практике знание, как проверить страховку ОСАГО на подлинность, не всегда дает возможность избежать контакта с мошенниками. Поэтому,

даже во время подписания договора о страховании не стоит терять бдительность:

1. Ни в коем случае не подписывайте договор и не передавайте деньги страховому агенту, если он предоставляет вам незаполненный полис или заполненный без соответствия с действующими нормами.

2. Не соблазняйтесь на предложения о скидках на покупку страховки. К примеру, если на квитанции или самом бланке полиса указана одна сумма, а страховая компания просит у вас сумму ниже, вероятнее всего, они желают продать вам недействительный полис.

3. Если на бланке полиса нет хотя бы одного из перечисленных в первом разделе визуальных атрибутов – о подписании договора о страховании не может быть и речи.

Обратите внимание! Бланк ОСАГО может утратить свою подлинность и по вашей вине, если вы вдруг решите самостоятельно внести в него свои правки. Если ваши изменения не совпадут с данными в страховой компании, получить компенсацию по такому полису у вас не получится.

4. После подписания договора обязательно сверьте все данные в копиях и своем заявлении. Учтите, что даже если в описании автомобиля будет указана хотя бы одна неправильная буква, договор по отношению к вашему авто будет недействительным.

Если своевременно учесть все эти факты, то необходимость в дополнительной проверке подлинности полиса ОСАГО отпадет автоматически.

Где мошенники берут недействительные полисы ОСАГО?

Довольно часто автовладельцы сталкиваются с тем, что покупают вроде как действительный полис страхования своего автомобиля (если учитывать все его визуальные характеристики), но на деле такой документ оказывается недействительным. Дело в том, что очень часто мошенники используют для этого не только бланки, изготовленные лично ими, но и:

• Бланки о страховании, которые были утеряны или украдены у других автовладельцев. Чтобы не попасться на такую уловку, подлинность полиса нелишним будет проверить даже непосредственно в момент его приобретения.

• Бланки, которые страховые компании не сдали, после того как расторгли договор с физическим лицом.

• Бланки, которые принадлежали страховой компании, которая уже лишилась своей лицензии, но которые не были сданы вышестоящим органам в установленном порядке.

Какие меры стоит предпринять, если оформленный полис оказался подделкой

К чему же может привести использование поддельного полиса ОСАГО? Если говорить о мошенниках, которые его продали автовладельцу, то за подобное нарушение закона им грозит серьезная уголовная ответственность (в УК РФ это

статья 327, предусматривающая наказание за подделку и сбыт поддельных документов – срок до 2 лет лишения свободы).

Что же касается владельца такого полиса, то если он сможет доказать, что это не он лично его изготовил, а именно в таком виде приобрел, то ему наказание закона не грозит. Правда, и получить компенсацию по такому полису не получится.

По этой причине, если проверка подлинности полиса ОСАГО прошла с отрицательным результатом, то сразу же после выявления факта мошенничества обратитесь к представителям закона. В частности, вам необходимо будет написать заявление в полицию о том, что вам была продана подлинная страховка. В заявлении также важно указать максимально точные данные о мошенниках и том, как они вышли с вами на контакт, а также приложить оригинал поддельного документа.

Не забудьте также после подачи заявления в полицию приобрести подлинный полис. Не стоит забывать, что езда по дорогам без наличия обязательной страховки ОСАГО также является правонарушением.

Первое, что вы должны сделать после ознакомления с этой статьей, – это взять свой полис ОСАГО и проверить его на подлинность. При этом не стоит доверять только его визуальным особенностям. Обязательно перейдите на сайт РСА и убедитесь, что он указан в государственной базе.

Подписывайтесь на наши ленты в таких социальных сетях как, Facebook, Вконтакте, Instagram, Pinterest, Yandex Zen, Twitter и Telegram: все самые интересные автомобильные события собранные в одном месте.

Как выполняется проверка подлинности ОСАГО по номеру полиса

Уже по названию ОСАГО понятно, что данный вид страхования обязателен для всех, кто имеет личный автотранспорт. Поскольку услуга относится к категории платных, ежегодно открываются новые частные конторы, предлагающие свое содействие за небольшой процент. Казалось бы, ничего такого. Но случаи мошенничества заметно участились. Желающий сэкономить автовладелец после подписания договора и оплаты услуги получает не настоящий, а поддельный бланк.

Для предотвращения подобных ситуаций был запущен сервис РСА. Там можно проверить подлинность полиса ОСАГО, введя его серийный номер и другие параметры. Но как это правильно сделать?

Особенности проверки полиса по номеру с помощью РСА

Не так давно Российским союзом автостраховщиков (РСА) был запущен сервис, позволяющий получать сведения о подлинности оформленного полиса ОСАГО. Это очень важно. Вед если документ окажется поддельным, то пострадавшее в ДТП лицо не сможет рассчитывать на правовую защиту и денежную компенсацию.

Все, что требуется от клиента,  – заполнить соответствующие поля, указав серию и номер полиса, а также ввести специальный код для запуска проверки. Если все было сделано правильно, то произойдет автоматическое перенаправление в базу данных РСА.

На сегодняшний день актуальными считаются следующие статусы, отражающие определенные данные:

• находится у страхователя. Этот статус, подтверждающий подлинность бланка, подразумевает указание сроков ОСАГО и сведений о страховой компании;
• находится у страховщика. Такое возможно при недавнем заключении договора. Сотрудники фирмы могли еще не успели осуществить ввод данных в реестр. Если же в течение долгого времени статус не подтверждается, то следует обратиться к агенту для уточнения информации;
• утерян/утратил силу. Это указывает на то, что полученный документ является обычной подделкой. Необходимо незамедлительно обращаться в полицию и заявлять о факте мошенничества.

Иные способы проверки

Если у автовладельца, получившего страховой полис, отсутствует доступ к базе РСА, однако он сомневается в компетентности агента, ему стоит обратиться к другим приемам, позволяющим определить подлинность ОСАГО.

Способ №1 – проведение визуального осмотра. Существует немало моментов, позволяющих понять, что перед вами подделка, а не настоящий документ. Официальный бланк на лицевой стороне имеет микросетку голубого или зеленого оттенка. На просвете видны водяные знаки. Также есть качественная печать, которая не оставляет следы на руках и каких-либо поверхностях. А еще номер настоящего полиса является 10-значным и выпуклым.

Способ №2 – проверка на право подписания договора. Клиент может требовать у фирмы документального подтверждения своих прав на получение страховки. В этом случае запрашивается лицензия, позволяющая осуществлять продажу бланков ОСАГО. Если лицензия просрочена, отозвана или приостановлена, то это повод задуматься.

А у вас были проблемы с оформлением ОСАГО?

границ | CTP-синтаза 2 из Arabidopsis thaliana необходима для полного развития эмбриона

Введение

Нуклеотиды являются важными строительными блоками для производства нуклеиновых кислот. Кроме того, нуклеотиды представляют собой основные носители энергии в биохимических реакциях и действуют как источник азота, углерода или фосфата в условиях ограничения азота и как кофакторы в биосинтезе фосфолипидов. По химической структуре нуклеотиды делятся на пурины и пиримидины (Kinney, 1993; Moffatt, Ashihara, 2002; Zrenner et al. , 2006). У растений метаболизм нуклеотидов состоит из (i) синтеза de novo , (ii) утилизации и (iii) деградации (Zrenner et al., 2006). Синтез пиримидина de novo состоит из шести ферментативных стадий, распределяемых в хлоропласте, цитозоле и митохондриях, которые заканчиваются производством монофосфата уридина (UMP) в цитозоле. Этот промежуточный продукт фосфорилируется киназой UMP до UDP. Моно-, ди- и трифосфаты уридина уравновешиваются нуклеозиддифосфаткиназами.Последней стадией синтеза пиримидина de novo является аминирование UTP до цитидинтрифосфата (CTP), проводимое исключительно с помощью CTP-синтаз (CTPS) (Moffatt and Ashihara, 2002; Zrenner et al., 2006; Witz et al., 2012). ). CTP-синтазы представляют собой консервативное семейство ферментов, встречающееся во многих царствах. Потребность в CTP как части ДНК особенно высока во время деления клеток и в развивающихся тканях. Таким образом, было описано, что активность CTPS регулируется на разных уровнях, например, посттрансляционно (посредством фосфорилирования) и аллостерически (через GTP), или обратная связь ингибируется его продуктом CTP (Levitzki and Koshland, 1972; Chang and Carman, 2008). Еще одна ферментативная регуляция — это полимеризация в филаменты, которая была изучена на нескольких организмах, таких как Escherichia coli , Saccharomyces cerevisiae , Drosophila melanogaster и Homo sapiens (Liu, 2010; Barry et al., 2014). et al., 2014; Lynch et al., 2017). CTPS растений были впервые описаны в Arabidopsis thaliana (далее именуемом Arabidopsis ) Daumann et al. (2018), описывая особенности пяти изоформ, включая способность образования филаментов.Изоформы демонстрируют тканеспецифические паттерны экспрессии, которые являются динамическими для CTPS1 и 4 при абиотических стрессах (Hruz et al., 2008; Daumann et al., 2018). Однако мутанты с единичным нокаутом не проявляли какого-либо фенотипа при режимах роста длинного или короткого дня, за исключением CTPS2. Нам не удалось получить гомозиготные линии вставки Т-ДНК для этой изоформы, что указывает на особую функцию во время развития или прорастания эмбриона (Daumann et al., 2018).

Шесть основных ферментативных стадий синтеза пиримидина de novo облегчаются пятью ферментами, каждый из которых кодируется одним геном.Гомозиготные нокаутные линии не могут быть получены, что указывает на существенную природу этого пути (Schröder et al., 2005). Антисмысловые линии аспартат-транскарбамоилазы (ATC) и дигидрооротазы (DHO), которые облегчают вторую и третью стадии синтеза пиримидина de novo , вызвали ограничения роста у Solanum tuberosum . Тем не менее, антисмысловые линии с 20% остаточного белка ATC или DHO были жизнеспособными и способны давать клубни. Кроме того, никаких изменений пулов нуклеотидов в полностью развитых тканях не наблюдалось, если экспрессия не упала ниже порогового значения, что указывает на эффективное спасение нуклеотидов у старых растений (Schröder et al., 2005). Детальный анализ потомства гетерозиготных мутантов с потерей функции на ферментативных стадиях синтеза пурина и пиримидина de novo и пластидном пентозофосфатном пути (обеспечивающем субстраты для синтеза и восстановления нуклеотида de novo ) выявил остановку на ранней стадии. стадии развития эмбриона (Andriotis, Smith, 2019). Это наблюдение подчеркивает важность нуклеотидного гомеостаза в этих тканях. В соответствии с этими открытиями, большой набор генов, кодирующих белки центральных путей, был классифицирован как необходимый для развития эмбриона ( генов EMB ), включая гены, участвующие в синтезе нуклеиновых кислот (Meinke, 1985, 2020).В связи с тем, что синтезу пиримидина de novo способствуют ферменты, которые в основном кодируются отдельными генами, неудивительно, что гомозиготные нокауты любого из этих генов нежизнеспособны. Поскольку Arabidopsis содержит пять изоформ CTP-синтазы, которые теоретически могут быть избыточными по функции, было удивительно, что не удалось получить гомозиготный нокаут для изоформы 2 (Daumann et al., 2018).

Здесь мы сообщаем, что CTPS2 необходим для правильного развития эмбриона, предположительно потому, что синтез CTP из UTP необходим в тканях эмбриона.Кроме того, наблюдалась тканеспецифическая экспрессия CTPS2 в зародышах и прерывание семени в + / ctps2 Silique. Молодые корни проростков также обнаруживают специфическую для клеточного типа экспрессию, которая реагирует на экзогенно поставляемый ауксин.

Материалы и методы

Растения и условия роста

Arabidopsis thaliana Экотип Columbia [обозначенный как дикий тип (WT)] использовался в этом исследовании вместе с линиями вставки T-ДНК CTPS2 (At3g12670) из коллекции GABI-Kat (Kleinboelting et al., 2012). Это были GABI_032C02 и GABI_156G07, обозначенные как + / ctps2-1 и + / ctps2-2 соответственно. Семена выращиваемых в почве растений высевали на стандартизированную почву ED73 (Einheitserde und Humuswerke Patzer, Бухенберг, Германия), инкубировали в течение 48 часов при 4 ° C для стратификации и переносили в камеры для выращивания в режиме длинного дня (14 часов света / 10 часов темноты. ). Условия выращивания: интенсивность света квантов 120 мкмоль ^–2 с ^–1 , температура 22 ° C и влажность 60%.Анализ сегрегации и промотора проводили с семенами, стерилизованными на поверхности, на чашках с агаром 1/2 Murashige – Skoog (MS) (Murashige and Skoog, 1962) с добавлением витаминов, 1% сахарозы (мас. / Об.), 0,05% MES – KOH ( мас. / об.), pH 5,7 и 0,8% агар. Поверхность семян стерилизовали добавлением 500 мкл 70% этанола с добавлением 0,1% Triton X-100 в течение 5 мин на встряхивающем устройстве для встряхивания. После 1 мин центрифугирования при 5000 g в течение 1 мин супернатант отбрасывали, и семена дважды промывали 100% этанолом в течение 1 мин.Раствор затравки / этанол немедленно переносили пипеткой на стерильную фильтровальную бумагу и сушили в потоке воздуха стерильного стола.

Строительство CTPS2 :: Линии дополнения GFP / GUS и CTPS2

Для конструирования линий CTPS2 :: GFP / GUS 1002 п.н. выше стартового кодона амплифицировали с помощью ПЦР с использованием смыслового и антисмыслового праймеров CTPS2_Promoter (дополнительная таблица 1). Затем амплифицированную последовательность разделяли на агарозном геле (1% мас. / Об.) И выделяли расщеплением геля с помощью набора NucleoSpin ^® Extract II (Macherey Nagel, Düren).После этого присоединяли att-сайты с помощью другой реакции ПЦР, амплифицированные фрагменты выделяли, как описано выше, и использовали для клонирования шлюза (праймеры, перечисленные в дополнительной таблице 1). После интеграции в вектор входа pDONR (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) другая реакция Gateway вставила конструкцию в pBGWFS7.0 (Karimi et al., 2002). Эта конструкция позволяет отслеживать активность ß-глюкуронидазы (GUS) и флуоресценцию зеленого флуоресцентного белка (GFP) из одной конструкции и одних и тех же трансформированных линий.Для простоты в соответствующих экспериментах мы обращаемся либо к CTPS2 :: GFP, либо к CTPS2 :: GUS. Трансформацию в растения Arabidopsis дикого типа проводили в соответствии с процедурой инокуляции цветков (Narusaka et al., 2012).

Комплементация + / ctps2-1 растений использовала 1,864 п.н. выше стартового кодона CTPS2 , то есть полную межгенную область выше по течению плюс область кодирования белка, включающую интроны CTPS2 (Schwacke et al., 2003).Соответствующий участок амплифицировали с помощью ПЦР с CTPS2_full-lenth смысловым и антисмысловым праймерами (дополнительная таблица 1) на геномной ДНК дикого типа (gDNA). После ПЦР амплифицированная последовательность была вставлена ​​в вектор входа pDONR (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), как описано выше, и далее в pMDC123 для комплементации + / ctps2 растений (Curtis and Grossniklaus, 2003). Безошибочная амплификация и вставка вектора проверяли ферментативным расщеплением и секвенированием по Сэнгеру (Seq-IT, Kaiserslautern, Германия).Праймеры, используемые для этого, перечислены в дополнительной таблице 1.

Конструкция комплементации CTPS2 была использована для трансформации растений + / ctps2-1 , как описано выше.

Световая микроскопия и подготовка проб

Стручки почвенных растений (WT и + / ctps2-1 ) собирали через 8–10 дней после внесения удобрений (DAF), продольно рассекали и помещали на предметное стекло микроскопа и покрывали парафильмом. Форму семян исследовали на 12–15 силиках DAF, которые сушили до 7 дней при комнатной температуре.Силиконы осторожно открывали под световым микроскопом и помещали на предметное стекло микроскопа, покрытое парафильмом для лучшего захвата. Здесь использовали растения WT, + / ctps2 и + / ctps2 растений, дополненные эндогенным CTPS2. Изображения были получены с помощью микроскопа Leica MZ10 F, оснащенного камерой Leica DFC420 C.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и подготовка проб

Развивающиеся стручки промоторных линий CTPS2 :: GFP собирали 1,5–8 DAF, препарировали, выделяли семена и переносили в 1.Реакционные пробирки на 5 мл. После добавления 10 мкл ddH ₂ O на семя зародыши осторожно выдавливали горшечником. Раствор эмбрион / вода переносили на предметные стекла и сразу использовали для микроскопии. Для исследования корней растений CTPS2 :: GFP семена помещали на чашки с агаром 1/2 MS, содержащие 1% агара, и помещали вертикально в камеру для выращивания. В указанные моменты времени проростки помещали в раствор йодида пропидия (PI) (0,01 мг / мл) для окрашивания клеточной стенки с последующей конфокальной лазерной сканирующей микроскопией.Изображения на рисунках 3, 5, 6 были получены с помощью микроскопа Leica TCS SP5II. Возбуждение для GFP составляло 488 нм, а регистрация излучения проводилась при 505–540 нм. Автофлуоресценция хлорофилла эмбрионов и флуоресценция PI детектировались при эмиссии 514 нм и при возбуждении 651–704 нм с помощью водно-иммерсионного объектива HCX PL APO 63 × 1,2 Вт.

Изображения на рисунке 4 и дополнительных рисунках 1, 4 были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM880, AxioObserver SP7 (INST 248 / 254-1), оснащенного Zeiss C-Apochromat 40 × 1.Водно-иммерсионный объектив AutoCorr M27 мощностью 2 Вт с настройками флуоресценции, как указано в работе Kaiser et al. (2019).

Изображения обрабатывали с использованием программного обеспечения Leica LAS X (версия 3.3) или Zeiss ZEN 2.3.

Лечение ауксином

Стерилизованные поверхности семена репортерных растений CTPS2 :: GFP помещали на чашки с агаром 1/2 MS и выращивали вертикально в течение 7 дней в камере длинного дня. После этого проростки переносили на 20 часов в чашки с агаром 1/2 MS, содержащим 250 нМ 1-нафталинуксусной кислоты (NAA). NAA солюбилизировали в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО) и добавляли к теплой среде 1/2 MS перед разливом планшетов. В качестве контроля 250 нМ ДМСО добавляли к другой партии планшетов, и такое же количество проростков переносили в контрольные условия, как и для обработки NAA.

Флуоресценцию детектировали с помощью Zeiss LSM880, как упоминалось выше. Изображения были обработаны с помощью ImageJ (версия 1.51j8), и среднее значение серого дано по флуоресценции 10 клеток трихобласта в пяти биологических повторностях.

Статистический анализ

Все эксперименты проводились не менее трех раз. Пределы прямоугольников на графиках представляют 25–75-й процентиль, горизонтальная линия — медиана, маленькая светло-серая рамка — среднее, а усы — минимальные и максимальные значения.

Результаты

Анализ сегрегации с добавлением цитидина

+ / ctps2 семян

Ранее мы идентифицировали две линии вставки CTPS2 Т-ДНК из коллекции Gabi-Kat, которые не смогли дать гомозиготного потомства (Daumann et al. , 2018). Эти гетерозиготные линии (GK_032C02 и GK_156G07) были обозначены как + / ctps2-1 и + / ctps2-2 соответственно. Предыдущий анализ сегрегации этих двух линий показал отклоняющуюся картину прорастания по сравнению с ожидаемым соотношением 1: 2: 1 для WT: гетерозиготного: гомозиготного потомства (Daumann et al., 2018). Таким образом, мы пришли к выводу, что ключевой функцией CTPS2, вероятно, является прорастание и / или развитие эмбриона. Чтобы подтвердить вышеупомянутую нерегулярную картину, мы повторили эксперимент в нашем исследовании и обнаружили, что почти 10% семян + / ctps2-1 и + / ctps2-2 , которые были посеяны на чашки с агаром 1/2 MS. не прорастали по сравнению с WT (Фигуры 1A, C), что указывает на гомозиготный нокаут CTPS2 в этих семенах.Поскольку синтез нуклеотида de novo очень энергоемкий, растения способны рециркулировать нуклеозиды по пути спасения (Zrenner et al., 2006). В этом случае поставляемые извне нуклеозиды могут быть импортированы с помощью уравнительного переносчика нуклеозидов 3 (ENT3) для фосфорилирования до нуклеотидов (Traub et al. , 2007). Добавление 1/2 чашек с агаром MS с 1 мМ цитидина для другого анализа сегрегации снова дает 10% непроращенных семян обеих линий + / ctps2 , тогда как семена WT росли нормально (Фигуры 1B, C).Это открытие предполагает, что критическая роль CTPS2 имеет место в производстве семян, а не в прорастании.

Рисунок 1. Прорастание линий + / ctps2 на чашках с агаром 1/2 MS. Семена дикого типа (WT) и + / ctps2 помещали на чашки с агаром (A) 1/2 Murashige-Skoog (MS) или (B) на чашки с добавлением 1 мМ цитидина. Белые стрелки указывают на непроращенные семена через 5 дней после переноса в камеры для выращивания. (C) количество проросших семян с применением 1 мМ цитидина и без него.Для каждого генотипа высевали в общей сложности 52 семени, и эксперимент повторяли трижды.

Siliques из

+ / ctps2 растений содержат почти 25% абортированных семян

Для детального исследования развития семян семена WT и + / ctps2-1 высевали в почву и отдельные растения разделяли в отдельные горшки. Гетерозиготная вставка Т-ДНК в + / ctps2-1 была подтверждена с помощью ПЦР с комбинациями ген-специфичных и Т-ДНК-специфичных праймеров, как указано в Daumann et al.(2018). После того, как растения начали репродуктивный рост, через 8 дней после оплодотворения (DAF) собирали стручки WT и + / ctps2-1 . Стручки WT содержали здоровые семена с зародышем темно-зеленого цвета внутри, тогда как стручки + / ctps2-1 показали под здоровыми семенами прозрачные, а также разрушенные семена коричневого цвета (рис. 2А). Чтобы проверить, может ли добавка пиримидинов спасти фенотип, соцветия трех растений + / ctps2-1 были удалены, за исключением одного соцветия с закрытыми бутонами.Эти растения орошали водой, содержащей 10 мМ цитидина, до тех пор, пока силикат не достигал 8 DAF. Тем не менее, свободные от зародыша и разрушенные семена все еще наблюдались (рис. 2А), что указывает на то, что цитидин не переносился в эмбрион или что эмбрион не может перерабатывать это соединение. Мы предположили, что абортированные семена гомозиготны по вставке Т-ДНК, и начали подсчет семян от + / ctps2 растений. В обеих линиях были обнаружены семена, которые были полностью сморщены или имели почти нормальный размер, но были плоскими (рис. 2В).Оба типа считались абортированными семенами. Из общего числа 2125 семян в WT 0,4% были абортированы, тогда как + / ctps2-1 содержали 22,3% и + / ctps2-2 21,9% абортированных семян в 2142 и 2475 семенах, соответственно (Рисунок 2C). Таким образом, при подсчете абортированных семян в стручках от потомства + / ctps2 были обнаружены почти ожидаемые 25% гомозиготных = нежизнеспособных семян. Причина, по которой это не отражается в нашем анализе всхожести, заключается в том, что многие сорванные и разрушенные семена теряются или не учитываются во время сбора урожая, очистки семян или посева.

Рисунок 2. Идентификация гомозиготных семян ctps2 . Siliques вскрывали через 8-10 дней после оплодотворения (DAF) от растений дикого типа (WT) и + / ctps2-1 растений. (A) орошение растений + / ctps2-1 10 мМ цитидином не может спасти фенотип абортированных семян. Двенадцать силиков DAF собирали и сушили при комнатной температуре, а семена собирали с помощью световой микроскопии. (B) красные стрелки указывают на свернувшиеся семена, а золотые стрелки указывают на бесцветные семена почти нормального размера, предположительно содержащие зародыши, задержанные в раннем развитии.Подсчет семян для WT, + / ctps2 и дополненных + / ctps2 растений. Масштабная линейка = 0,25 мм для (A) и 1 мм для (B) . n = 3 для WT и + ctps2-1 , всего 38 и 40 силикатов соответственно; n = 4 для + / ctps2-1 :: CTPS2 и + / ctps2-2 :: CTPS2 всего 38 и 36 кремнеземов соответственно; n = 5 для + / ctps2-2 с 52 силикатами в (C) .

Рисунок 3. Флуоресцентная визуализация линий CTPS2 :: GFP в эмбриональных клетках. Стволы выращенных в почве растений (линии CTPS2 :: GFP # 10 и # 15) открывали через 2 дня после внесения удобрений (DAF) и между 6 и 8 DAF, и собирали семена. Семяпочки и зародыши выделяли из семян для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Показаны типичные изображения. Масштабная линейка = 100 мкм.

Рис. 4. Основные моменты флуоресцентной визуализации CTPS2 :: GFP. Эмбрионы выделяли из кремнеземов через 8 дней после оплодотворения (DAF) для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.Для этого были использованы строки CTPS2 :: GFP # 10 и # 15 и выбраны типовые изображения. Масштабная линейка = 10 мкм для (A) и 100 мкм для (B) . Максимальное проецирование 24 изображений в (B) .

Рис. 5. Флуоресцентная визуализация линий CTPS2 :: GFP в молодых корнях проростков. Проростки выращивали на чашках с агаром 1/2 Murashige – Skoog (MS) и в указанные моменты времени переносили на предметные стекла с пропидий йодидом, содержащим воду, для окрашивания клеточной стенки и последующей конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с микроскопом Leica TCS SP5II. CTPS2 :: GFP строки # 10 и # 15 были использованы. Показаны типичные изображения. Масштабная линейка = 25 мкм. DAG, дни после прорастания.

Рис. 6. Флуоресцентная визуализация линий CTPS2 :: GFP в корнях проростков. Условия роста и микроскопии, как на рисунке 5. Масштабная линейка = 25 мкм. DAG, дни после прорастания.

Интеграция полной белковой кодирующей последовательности CTPS2 под контролем полного эндогенного промотора (1,864 п.н. выше ATG) в растения + / ctps2 привела в среднем только к 5% абортированных семян в обеих линиях, демонстрируя, что фенотип был по крайней мере частично дополнен (рис. 2C).Мы также стремились спасти фенотип семян + / ctps2 за счет экспрессии изоформ CTPS1-4, управляемых промотором UBQ в виде конструкций слияния YFP (уже в наших руках, описанных в Daumann et al., 2018). Для этого трансформировали растения + / ctps2 , положительные трансформанты проверяли на устойчивость к канамицину и проверяли с помощью ПЦР. Три растения на трансформированную конструкцию и 4–10 стручков от соответствующих растений проверяли на наличие WT-подобных семян, но ни в одном случае комплементация не была успешной.Кроме того, ПЦР-проверка трансформированного потомства этих трансформантов ни в коем случае не выявила гомозиготной вставки Т-ДНК. Таким образом, CTPS2, управляемый эндогенным промотором, по-видимому, имеет решающее значение для правильного развития эмбриона.

CTPS2 :: Линии GFP / GUS выявляют тканеспецифичные

CTPS2 Экспрессия во время развития эмбриона

Для визуализации активности промотора CTPS2 использовали 1002 п.н. перед стартовым кодоном. Эту нуклеотидную последовательность клонировали в pBGWFS7.0 (Karimi et al., 2002) и посредством этого трансляционно слит с меткой eGFP и β-глюкуронидазы (GUS). Идентифицировали пять положительных трансформантов, и геномную интеграцию конструкции подтвердили с помощью ПЦР. Аналогичная картина окрашивания GUS наблюдалась во всех пяти линиях, и для дальнейшего анализа были выбраны линии CTPS2 :: GFP / GUS # 10 и # 15.

Гистохимическое окрашивание линий CTPS2 :: GUS выявило экспрессию в корнях, листьях и цветках растений Arabidopsis на протяжении всего развития (дополнительный рисунок 1).Пятидневные проростки показали окрашивание GUS в корне (особенно в кончиках первичных и вторичных корней), апикальной меристеме побега, ткани сосудистой сети листьев и нитях цветков (дополнительный рисунок 1).

Оплодотворенные семяпочки примерно при 1,5 DAF показали сильные сигналы CTPS2 :: GFP в периферическом и халазальном эндосперме, но с самым сильным сигналом флуоресценции в периферическом эндосперме (Рисунок 3). Эмбрион Arabidopsis развивается до 6 DAF стадии сердца, а затем быстро развивается до зрелого эмбриона до 8 DAF (Feng and Ma, 2017).Повышенная экспрессия наблюдалась от глобулярных до сердечных эмбрионов в обзоре экспрессии в масштабе всего генома (Winter et al., 2007). В этом исследовании максимальная экспрессия по всем тканям Arabidopsis наблюдалась на стадии скрученной семядоли. Мы проследили экспрессию CTPS2 во время быстрого развития до стадии зрелого эмбриона. На ранней стадии сердца мы наблюдали точечный рисунок флуоресценции, преимущественно в клетках колумеллы эмбрионов. Даже на виде сбоку, повернутом на 90 °, эмбрион на поздней стадии сердца показал тот же паттерн экспрессии, но сигнал флуоресценции был специфически локализован только на двух или четырех клетках кончика корня (рис. 3).Когда эмбрион развивается до стадии изогнутой семядоли, сигнал флуоресценции в этих клетках колумеллы остается сильным. Когда эмбрион достигает зрелой стадии, флуоресценция CTPS2 :: GFP наблюдалась и в других тканях, кроме колумеллы. При этом промоторная активность наблюдалась в обеих семядолях (фиг. 3). Удивительно, но сильный сигнал флуоресценции в клетках эмбриона колумеллы, по-видимому, возникает только в двух клетках, где раньше была связь между эмбриональными и суспензорными клетками (рис. 4А).Ранний зародыш, а также клетки эндосперма связаны с материнской тканью через суспензор, чтобы обеспечить поступление питательных веществ и фитогормонов материнским растением (Bozhkov et al. , 2005; Robert et al., 2018). Более того, максимальная проекция зрелого эмбриона выявила сильную флуоресценцию CTPS2 :: GFP в клетках эпидермиса корня, а также в семядолях (Рисунок 4B). Особенно в клетках эпидермиса корня стало очевидно, что сигнал флуоресценции не распределялся однородно, но, по-видимому, присутствовал в более поздних клетках атрихобластов или трихобластов (рис. 4В).Эти находки позволяют предположить, что CTPS2 пространственно-временно экспрессируется в клетках колумеллы развивающегося эмбриона. После 7 DAF экспрессия распространяется на другие ткани корня и семядолей.

CTPS2 :: Флуоресценция GFP в корнях проростков ограничена клетками колумеллы и трихобластами

Из-за нерегулярного характера экспрессии CTPS2 в эмбрионе корни молодых проросших проростков были изучены более подробно. Через день после прорастания сигнал флуоресценции CTPS2 :: GFP был очень сильным в клетках кончика корня (рис. 5).В отличие от изображений, которые мы получили от развивающихся эмбрионов, корни были окрашены интеркалирующим красителем пропидия иодидом. Таким образом, мы обнаружили, что флуоресценция CTPS2 :: GFP была ограничена двумя центральными клетками на кончике корня (рис. 5). В то время как интенсивность сигнала флуоресценции в центральных клетках кончика корня со временем снижалась, он полностью отсутствовал в клетках этого типа через 5 дней после прорастания (рис. 5). Когда проросток становится 5 дней и старше, сигнал флуоресценции смещается в сторону удлинения, а затем в сторону зоны дифференцировки (рисунки 5, 6).В зоне дифференцировки активность промотора CTPS2 была обнаружена только в молодых и развивающихся клетках корневых волосков (трихобластах) (рисунок 6 и дополнительный рисунок 2), что снова указывает на сильную пространственно-временную экспрессию CTPS2 (рисунок 6 и дополнительный рисунок). 2). Наблюдая за отростком первичного корня, сигналы флуоресценции были ограничены файлами клеток трихобласта, которые всегда разделены по крайней мере одним файлом клеток атрихобласта (дополнительный рисунок 4B). Интересно, что мы обнаружили сильную экспрессию CTPS2 снова в клетках кончика корня боковых корней, подчеркивая наблюдаемую сильную пространственно-временную экспрессию (Рисунок 6 и дополнительный рисунок 2).

Обработка ауксином увеличивает CTPS2 :: GFP флуоресценцию

Поскольку активность промотора CTPS2 в клетках колумеллы выявила аналогичный сигнал флуоресценции по сравнению с установленным репортером ауксина DR5 :: GFP, мы выровняли нуклеотидную последовательность элемента ответа на ауксин (TGTCTC) с последовательностью промотора CTPS2 , использованной в данное исследование (Ulmasov et al., 1995, 1997; Feng, Ma, 2017). В рамках выравнивания мы обнаружили повтор элемента ответа на ауксин (AuxRE) в промоторе CTPS2 в положении 652–665 перед экзоном 1, прерванный двумя основаниями CG (дополнительная фигура 3).Это открытие указывает на то, что CTPS2 может регулироваться ауксином. Для подтверждения этого открытия две репортерные линии CTPS2 # 10 и # 15 выращивали на чашках с агаром 1/2 MS в течение 7 дней и переносили на чашки с агаром 1/2 MS, дополненные 250 нМ 1-NAA или 250 нМ ДМСО. После 20-часового роста конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с последующим анализом интенсивности флуоресценции с использованием ImageJ (версия 1.51j8) показала действительно более высокую интенсивность сигнала GFP в отдельных трихобластах растений, обработанных NAA (дополнительный рисунок 4).В контрольных условиях среднее значение серого на клетку линий №10 и №15 составляло 184,7 и 159,4 соответственно. Обработка NAA значительно увеличила среднее значение серого на клетку в обеих линиях, что привело к 216,8 для линии № 10 и 220,8 для линии № 15 (фиг. 7). Примечательно, что увеличение интенсивности флуоресценции было наиболее заметно в клетках трихобластов обеих линий; Обработка NAA дополнительно индуцировала флуоресценцию в клетках коры корня и частично в атрихобластах (дополнительная фигура 4). Однако не было обнаружено значительного увеличения интенсивности клеточной флуоресценции для клеток коры корня (данные не показаны).

Рисунок 7. Количественная оценка интенсивности флуоресценции CTPS2 :: GFP в трихобластах после нанесения 1-нафталинуксусной кислоты (NAA). Пятидневные проростки, выращенные на чашках с агаром 1/2 Murashige-Skoog (MS), переносили на 250 нМ NAA или контрольные чашки [диметилсульфоксид (DMSO)] на 20 часов. Интенсивность флуоресценции корней от пяти проростков на обработку 20 клетками на анализируемый корень представлена ​​в виде прямоугольных диаграмм. Белые и серые прямоугольники представляют собой среднее значение для растений, обработанных ДМСО и NAA, соответственно.Медиана показана белой или черной линией на прямоугольной диаграмме DMSO или NAA, соответственно. Звездочки указывают на статистически разные данные (тест Стьюдента t , p <0,05).

Обсуждение

Во время развития растений особенно молодым тканям требуется огромное количество нуклеотидов для деления и роста клеток, например, для синтеза рибосом. Поэтому предполагается, что скорость синтеза de novo в проростках и растущих тканях обычно высока (Zrenner et al., 2006). Эта гипотеза была подтверждена обнаружением сильной экспрессии аспартат-транскарбамоилазы, фермента, который совершает лимитирующую стадию в синтезе пиримидина de novo в Arabidopsis (Bassett et al., 2003; Chen and Slocum, 2008). Снижение синтеза нуклеотида de novo , вызванное более низкой экспрессией UMP-синтазы, увеличивает активность пиримидина в спасении растущих клубней картофеля (Geigenberger et al., 2005). Напротив, дифференцированные клетки поддерживают свои пулы нуклеотидов за счет спасения и компенсируют катаболические процессы за счет незначительной активности синтеза de novo (Zrenner et al., 2006). Следовательно, поставляемый извне нуклеозид цитидин, который может быть импортирован в растения с помощью ENT3 (Traub et al., 2007) и может фосфорилироваться до CMP с помощью уридин / цитидинкиназы (Ohler et al., 2019), должен обеспечивать компенсацию потери активности CTP-синтазы в ctps2 проростках. Однако применение 1 мМ цитидина не преодолело фенотип прорастания семян ctps2 (рис. 1). Наряду с обнаружением того, что стручки от + / ctps2 растений содержат почти 25% абортированных семян, которые также не могут быть спасены путем орошения 10 мМ цитидинсодержащей водой, а путем добавления + / ctps2 растений с CTPS2 под контролем эндогенного промотора, мы заключаем, что решающая функция CTPS2 лежит в развитии эмбриона (Рисунок 2).Транспортировка цитидина к эмбриону, соответствующая деятельность по спасению или способность импортировать, по-видимому, недостаточны для спасения развития эмбриона.

Из работы над D. melanogaster известно, что развитие яйцевой камеры сопровождается высокой потребностью в нуклеотидах и накоплением CTP-синтазы, чтобы обеспечить повышенный синтез рибосомной РНК (рРНК) (Aughey et al., 2016). Неожиданно флуоресценция CTPS2 :: GFP была ограничена кончиком клеток колумеллы в эмбрионах сердца и на более поздних стадиях.Во время развития эмбриона флуоресценция CTPS2 :: GFP наблюдалась в других эмбриональных тканях после 7 DAF (Фигуры 3, 4). В отличие от этого, мы заметили относительно сильную флуоресценцию в периферическом эндосперме семяпочек 1,5 DAF (рис. 3, верхняя панель). Наряду с обнаружением разрушенных и свободных от зародышей семян в 8–10 DAF стручках растений + / ctps2-1 , вероятно, что нокаут CTPS2 вызывает остановку эмбрионального роста на раннем этапе развития эмбриона. Андриотис и Смит (2019) обнаружили, что нарушение синтеза пуринов вызывает остановку роста и прерывание эмбриона на глобулярной стадии.Это также было обнаружено для генов окислительного пентозофосфатного пути, обеспечивая прекурсоры для синтеза фосфорибозилпирофосфата (косубстрат в синтезе нуклеотида de novo ) и синтазы UMP. Таким образом, мы предполагаем, что CTPS2 является геном EMB , что соответствует результатам Meinke (2020), вызывая задержку роста на раннем этапе развития эмбриона. Более того, нокаут ферментов в синтезе пиримидина de novo , который кодируется одним геном, приводит к летальному исходу для эмбриона (Schröder et al., 2005; Чен и Слокум, 2008). Поскольку Arabidopsis обладает пятью генами CTP-синтазы, их пространственно-временная регуляция вероятна и может объяснить, почему нокауты CTPS2 не могут быть дополнены другими изоформами CTP-синтазы. Конечно, можно утверждать, что сильные промоторы в качестве промотора UBQ, используемые в нашем подходе, приводящие к относительно высокой экспрессии трансгенов, должны позволять дополнять отсутствующую экспрессию. Однако вполне может быть, что в этом случае требуется профиль экспрессии или реакция на ауксин.Мы также не можем исключить, что более интенсивный поиск дополняющих строк увенчается успехом. Тем не менее, никакая другая CTP-синтаза Arabidopsis не содержит повтора AuxRE в своем промоторе, за исключением CTPS2 . Однако почему экспрессия CTPS2 ограничена клетками кончика колумеллы в развивающемся эмбрионе? Stadler et al. (2005) установили мобильный и связанный с мембраной подход GFP под контролем промотора At SUC3, который позволяет отслеживать движение от клетки к клетке. At Активность промотора SUC3 была описана в нескольких тканях стока, а также в суспензоре (Meyer et al., 2004). Тем не менее, Stadler et al. (2005) наблюдали сигналы флуоресценции GFP у эмбрионов на глобулярной стадии, сделав вывод, что суспензор и ранний эмбрион строят симпластическую систему. После разъединения суспензора и эмбриона (Bozhkov et al., 2005) и прогрессирования в развитии эмбриона флуоресценция GFP становится все более и более ограниченной отдельными типами клеток, например, клетками эпидермиса (Stadler et al., 2005). Это означает, что симпластическое движение макромолекул больше не облегчается у более старых эмбрионов, но тканеспецифическая связь с помощью плазмодесм все еще должна сохраняться (Stadler et al., 2005). Считается, что молекулы с массой до 800 Да могут свободно диффундировать посредством симпластического транспорта (Lalonde et al., 2004; Karmann et al., 2018). Поскольку CTP имеет массу 483 Да, можно предположить, что CTPS2 продуцирует CTP в эмбриональных клетках колумеллы, который затем симпластически распределяется между всеми эмбриональными клетками.Уменьшение количества плазмодесм во время дальнейшего развития запускает активность CTPS2 в других типах клеток, что приводит к флуоресценции GFP в клетках эпидермиса и семядолях (рис. 4B).

Паттерн экспрессии CTPS2 был подобен таковому у репортера ауксина DR5 :: GFP (Feng and Ma, 2017) во время эмбриогенеза, а повтор AuxRE был локализован в промоторной области CTPS2 (дополнительный рисунок 4). Материнские ткани снабжают эмбрион ауксином до глобулярной стадии, когда эмбрион способен сам производить ауксин (Robert et al., 2018). При оплодотворении яйцеклетки суспензионные клетки экспрессируют PIN7 для направленного транспорта ауксина к эмбриону, и концентрация ауксина высока на базальном конце эмбриона (Friml et al., 2003). Когда эмбрион начинает независимую продукцию ауксина в своих апикальных клетках, активируется экспрессия PIN1, в результате чего возникает апикально-базальный градиент ауксина, накапливающий ауксин в базальном конце эмбриона и в верхних клетках суспензора (Friml et al., 2003; Vieten et al. др., 2005; Роберт и др., 2013, 2018).Рост — это время высокой потребности в нуклеотидах; таким образом, очевидно, имеет смысл связывание экспрессии CTPS с ауксином гормона роста. Симпластическое соединение эмбриональных клеток могло бы позволить распределение нуклеотидов (CTP) внутри эмбриона. В то же время такая система, возможно, позволила бы лучше регулировать по сравнению со спасением цитидина, полученного из флоэмы, чего, согласно нашим результатам, не происходит.

В корне DR5 :: GFP экспрессируется в первичном и боковом кончиках корня, особенно в клетках колумеллы, аналогично наблюдениям, сделанным в этом исследовании [Рисунки 5, 6 (Wabnik et al., 2011; Raya-González et al., 2018]. DR5 :: GFP и DR5 :: GUS представляют собой ауксин-чувствительные системы промотор-репортер, использующие повторы последовательности длиной 11 п.н., содержащей последовательность TGTCTC в синтетическом промоторе DR5 (Ulmasov et al., 1997; Ottenschläger et al., 2003) . Следовательно, очевидно, что сигналы флуоресценции GFP, наблюдаемые под контролем промотора CTPS2 , не так интенсивны, как сигналы DR5 :: GFP, но могут быть усилены применением ауксина (рисунок 7 и дополнительный рисунок 4). Однако колумелла — очень динамичная ткань, которая, вероятно, требует большого количества CTP.Помимо использования в качестве строительного блока для РНК и ДНК в дрожжах, CTP является важным предшественником в биосинтезе мембранных фосфолипидов. Хотя CTP ингибирует активность фермента CTPS, у дрожжей было показано, что фосфорилирование CTPS стимулирует его активность и увеличивает эндогенные концентрации CTP (Chang and Carman, 2008). Поскольку механизмы посттранскрипционной регуляции и биохимические свойства растительных CTPS еще полностью не изучены (Daumann et al., 2018), возможно, что CTPS из Arabidopsis могут регулироваться аналогично дрожжевым CTPS.

Уже в зрелых эмбрионах наблюдали паттерн экспрессии CTPS2 , выстилающий продольные ряды клеток, напоминающий паттерн трихобласт / атрихобласт в корнях развивающихся растений (фиг. 4B). Более того, образование корневых волосков инициируется ауксином, и мы фактически наблюдали экспрессию CTPS2 в клетках корневых волосков. Фитогормон стимулирует AuxRE и тем самым индуцирует специфические для трихобластов киназы, которые инициируют удлинение трихобластов (Vissenberg et al., 2020). Основным компонентом мембран растений является фосфатидилхолин, и для его синтеза de novo требуется холин CDP, доставляемый по пути Кеннеди.Одним из начальных шагов является перенос цитидильной части от ЦТФ на фосфохолин (Kennedy, 1958; Caldo et al., 2019). Переход от клетки трихобласта к корневому волоску, который в конечном итоге остается одной клеткой, требует огромных количеств мембранных фосфолипидов и, следовательно, CTP (Kinney, 1993). Наряду с нашим обнаружением высокой активности промотора CTPS2 в трихобластах (рисунок 6 и дополнительный рисунок 2), было обнаружено, что транскрипт CTPS2 активируется в анализе РНК-seq на корневых волосковых клетках Arabidopsis (Huang et al., 2017).

В совокупности мы заключаем из наших данных, что CTPS2 требуется для развития эмбриона. Мы предполагаем, что ауксин может действовать на регуляцию транскрипции CTPS2 в корнях зародыша и проростков и, таким образом, влиять на их развитие.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направить соответствующему автору.

Авторские взносы

DH генерировал линии комплементационных и промотор-репортерных генов и анализировал развитие и прорастание семян.DH и DS выполняли конфокальную микроскопию. Д.С. посоветовал провести эксперименты по лечению ауксином и количественную оценку интенсивности флуоресценции, проводимую DH. Все авторы внесли свой вклад в дизайн исследования и написали рукопись.

Финансирование

Это исследование было поддержано DFG-Grant MO 1032 / 5-1 TM и финансированием BioComp Research Initiative из земли Рейнланд-Пфальц (Германия) DS и TM.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.652434/full#supplementary-material

Список литературы

Андриотис В. М., Смит А. М. (2019). Пластидный пентозофосфатный путь важен для постглобулярного развития эмбрионов Arabidopsis . Proc. Natl. Акад. Sci.U.S.A. 116, 15297–15306. DOI: 10.1073 / pnas.16116

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барри, Р.М., Битбол, А. Ф., Лорестани, А., Чарльз, Э. Дж., Хабриан, К. Х., Хансен, Дж. М. и др. (2014). Крупномасштабное образование филаментов подавляет активность CTP-синтетазы. Элиф 3: e03638.

Google Scholar

Бассет, Э. В., Буше, Б. Ю., Карр, Дж. М., Уильямсон, К. Л., и Слокум, Р. Д. (2003). PALA-опосредованное пиримидиновое голодание увеличивает экспрессию аспартат-транскарбамоилазы (pyrB) в проростках Arabidopsis . Plant Physiol. Biochem. 41, 695–703.DOI: 10.1016 / s0981-9428 (03) 00094-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Божков, П. В., Филонова, Л. Х., Суарес, М. Ф. (2005). Запрограммированная гибель клеток в эмбриогенезе растений. Curr. Верхний. Развивать. Биол. 67, 135–179. DOI: 10.1016 / s0070-2153 (05) 67004-4

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кальдо, К. М. П., Сюй, Ю., Фаларз, Л., Джаявардхане, К., Аседо, Дж. З., и Чен, Г. (2019). Arabidopsis CTP: фосфохолинцитидилилтрансфераза 1 фосфорилируется и ингибируется неферментирующей сахарозой 1-родственной протеинкиназой 1 (SnRK1). J. Biol. Chem. 294, 15862–15874. DOI: 10.1074 / jbc.ra119.008047

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чанг, Ю. Ф., и Карман, Г. М. (2008). CTP-синтетаза и ее роль в синтезе фосфолипидов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Прог. Губа. Res. 47, 333–339. DOI: 10.1016 / j.plipres.2008.03.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, К. Т., и Слокум, Р. Д. (2008). Экспрессия и функциональный анализ аспартат-транскарбамоилазы и роль синтеза пиримидина de novo в регуляции роста и развития у арабидопсиса . Plant Physiol. Biochem. 46, 150–159. DOI: 10.1016 / j.plaphy.2007.10.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Curtis, M. D., and Grossniklaus, U. (2003). Набор векторных клонирующих векторов для высокопроизводительного функционального анализа генов плантаций. Plant Physiol. 133, 462–469. DOI: 10.1104 / стр.103.027979

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дауман, М., Хикл, Д., Циммер, Д., ДеТар, Р.А., Кунц, Х. Х., Мёльманн, Т. (2018). Характеристика филамент-образующих CTP-синтаз из Arabidopsis thaliana . Plant J. 96, 316–328. DOI: 10.1111 / tpj.14032

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фэн Дж. И Ма Л. (2017). Метод характеристики эмбриогенеза Arabidopsis . JoVE (J. Visualized Exp.) 126: e55969.

Google Scholar

Фримл, Дж., Виетен, А., Зауэр, М., Weijers, D., Schwarz, H., Hamann, T., et al. (2003). Градиенты оттока ауксина устанавливают апикально-базальную ось Arabidopsis . Природа 426, 147–153. DOI: 10.1038 / nature02085

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гейгенбергер П., Региерер Б., Нунес-Неси А., Лейсс А., Урбанчик-Вочняк Э., Спрингер Ф. и др. (2005). Ингибирование синтеза пиримидина de novo в растущих клубнях картофеля приводит к компенсаторной стимуляции пути утилизации пиримидина и последующему повышению биосинтетических свойств. Растительная клетка 17, 2077–2088. DOI: 10.1105 / tpc.105.033548

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hruz, T., Laule, O., Szabo, G., Wessendorp, F., Bleuler, S., Oertle, L., et al. (2008). Genevestigator v3: эталонная база данных экспрессии для метаанализа транскриптомов. Adv. Bioinf. 2008: 420747.

Google Scholar

Хуанг, Л., Ши, X., Ван, В., Рю, К. Х., и Шифельбейн, Дж. (2017). Диверсификация генов развития корневых волосков у сосудистых растений. Plant Physiol. 174, 1697–1712. DOI: 10.1104 / стр.17.00374

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кайзер, С., Эйса, А., Кляйне-Вен, Дж., И Шойринг, Д. (2019). NET4 модулирует компактность вакуолей в Arabidopsis thaliana . Внутр. J. Mol. Sci. 20: 4752. DOI: 10.3390 / ijms20194752

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карими М., Инзе Д. и Депикер А. (2002). GATEWAY ^TM векторы для опосредованной Agrobacterium трансформации растений. Trends Plant Sci. 7, 193–195. DOI: 10.1016 / s1360-1385 (02) 02251-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карманн Дж., Мюллер Б. и Хаммес У. З. (2018). Долгая и извилистая дорога: пути переноса аминокислот в семенах Arabidopsis . Завод Репро. 31, 253–261. DOI: 10.1007 / s00497-018-0334-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кеннеди, Э. П. (1958). Биосинтез фосфолипидов. г. J. Clinic. Орех. 6, 216–220.

Google Scholar

Кинни, А. Дж. (1993). «Липидный обмен» в растений. Головные группы фосфолипидов , изд. Т. С. Мур (Бока-Ратон: CRC Press).

Google Scholar

Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., and Weisshaar, B. (2012). Простой поиск GABI-Kat: новые возможности базы данных мутантов Arabidopsis thaliana T-ДНК. Nuc. Кислота. Res. 40, 1211–1215.

Google Scholar

Лалонд С., Випф Д. и Фроммер В. Б. (2004). Механизмы переноса органических форм углерода и азота между источником и поглотителем. Annu. Rev. Plant Biol. 55, 341–372. DOI: 10.1146 / annurev.arplant.55.031903.141758

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Левицки А. и Кошланд Д. Э. младший (1972). Роль аллостерического эффектора. активация гуанозинтрифосфата в цитозинтрифосфатсинтетазе. Биохимия 11, 241–246. DOI: 10.1021 / bi00752a015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю, Дж. Л. (2010). Внутриклеточная компартментация CTP-синтазы у Drosophila . J. Gen. Gen. 37, 281–296. DOI: 10.1016 / s1673-8527 (09) 60046-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Линч, Э. М., Хикс, Д. Р., Шеперд, М., Эндриззи, Дж. А., Мейкер, А., Хансен, Дж. М. и др. (2017). Структура филаментов CTP-синтазы человека выявляет конформацию активного фермента. Нац. Struc. Мол. Биол. 24, 507–514. DOI: 10.1038 / nsmb.3407

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Meinke, D. W. (1985). Эмбрио-летальные мутанты Arabidopsis thaliana : анализ мутантов с широким диапазоном летальных фаз. Теор. Прил. Gen. 69, 543–552. DOI: 10.1007 / bf00251102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мейнке, Д. У. (2020). Полногеномная идентификация ЭМБРИО-ДЕФЕКТНЫХ (EMB) генов, необходимых для роста и развития Arabidopsis . New Phytol. 226, 306–325. DOI: 10.1111 / Nph.16071

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мейер, С., Лаутербах, К., Нидермайер, М., Барт, И., Шолунд, Р. Д., и Зауэр, Н. (2004). Ранение усиливает экспрессию AtSUC3, переносчика сахарозы из ситовых элементов Arabidopsis и поглощающих тканей. Plant Physiol. 134, 684–693. DOI: 10.1104 / стр.103.033399

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мурашиге, Т.и Скуг Ф. (1962). Обновленная среда для быстрого роста и биологических анализов с культурами тканей табака. Physiol. Завод 15, 473–497. DOI: 10.1111 / j.1399-3054.1962.tb08052.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нарусака Ю., Нарусака М., Ямасаки С. и Ивабучи М. (2012). «Методы передачи чужеродных генов растениям» в Сельскохозяйственные и биологические науки »Трансгенные растения — достижения и ограничения , изд. Ю. О. Чифтчи (Лондон: InTech Open), 173–188.

Google Scholar

Нори К., Монфорт Э., Шиау А. К. и Вильгельм Дж. Э. (2014). Общий регуляторный контроль активности фермента CTP-синтазы и образования филаментов. Мол. Биол. Клетка. 25, 2282–2290. DOI: 10.1091 / mbc.e14-04-0912

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Олер, Л., Ниопек-Витц, С., Мейнге, С. Э., и Мёльманн, Т. (2019). Спасение пиримидина: физиологические функции и взаимодействие с биогенезом хлоропластов. Plant Physiol. 180, 1816–1828 гг. DOI: 10.1104 / стр.19.00329

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Оттеншлегер И., Вольф П., Волвертон К., Бхалерао Р. П., Сандберг Г., Исикава Х. и др. (2003). Регулируемый гравитацией дифференциальный транспорт ауксина из колумеллы в клетки бокового корня. Proc. Natl. Акад. Sci.U.S.A. 100, 2987–2991. DOI: 10.1073 / pnas.0437936100

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Райя-Гонсалес, Х., Oropeza-Aburto, A., López-Bucio, J. S., Guevara-García, ÁA., De Veylder, L., López-Bucio, J., et al. (2018). MEDIATOR18 влияет на корневую архитектуру Arabidopsis , подавляет передачу сигналов ауксина и является критическим фактором для жизнеспособности клеток в корневых меристемах. Plant J. 96, 895–909.

Google Scholar

Роберт, Х.С., Гронес, П., Степанова, А.Н., Роблес, Л.М., Локерс, А.С., Алонсо, Дж. М. и др. (2013). Местные источники ауксина ориентируют апикально-базальную ось у эмбрионов Arabidopsis . Curr. Биол. 23, 2506–2512. DOI: 10.1016 / j.cub.2013.09.039

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Роберт, Х. С., Парк, К., Гутьеррес, К. Л., Вуйчиковска, Б., Пенчик, А., Новак, О., и др. (2018). Поставка материнского ауксина способствует раннему формированию паттерна эмбриона у Arabidopsis . Нац. Растения 4, 548–553. DOI: 10.1038 / s41477-018-0204-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шредер, М., Гирманн Н. и Зреннер Р. (2005). Функциональный анализ пути синтеза пиримидина de novo у пасленовых. Plant Physiol. 138, 1926–1938. DOI: 10.1104 / стр.105.063693

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schwacke, R., Schneider, A., van der Graaff, E., Fischer, K., Catoni, E., Desimone, M., et al. (2003). ARAMEMNON, новая база данных по интегральным мембранным белкам Arabidopsis . Plant Physiol. 131, 16–26.DOI: 10.1104 / pp.011577

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Штадлер Р., Лаутербах К. и Зауэр Н. (2005). Перемещение зеленого флуоресцентного белка от клетки к клетке выявляет пост-флоэмный транспорт во внешних покровах и идентифицирует симпластные домены в семенах и зародышах Arabidopsis . Plant Physiol. 139, 701–712. DOI: 10.1104 / стр.105.065607

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Трауб, М., Flörchinger, M., Piecuch, J., Kunz, H.H., Weise-Steinmetz, A., Deitmer, J. W., et al. (2007). Нечувствительный к фторуридину мутант 1 (fur1) дефектен в равновесном переносчике нуклеозидов 3 (ENT3) и, таким образом, представляет собой важную систему захвата пиримидиновых нуклеозидов в Arabidopsis thaliana . Plant J. 49, 855–864. DOI: 10.1111 / j.1365-313x.2006.02998.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ульмасов Т., Лю З. Б., Хаген Г.и Гилфойл Т. Дж. (1995). Составная структура ауксиновых ответных элементов. Растительная клетка 7, 1611–1623. DOI: 10.2307 / 3870023

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ульмасов Т., Мерфетт Дж., Хаген Г. и Гилфойл Т. Дж. (1997). Белки Aux / IAA подавляют экспрессию репортерных генов, содержащих природные и высокоактивные синтетические элементы ответа на ауксин. Растительная клетка 9, 1963–1971. DOI: 10.2307 / 3870557

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Витен, А., Ваннест, С., Вишневска, Дж., Бенкова, Э., Беньямин, Р., Бекман, Т. и др. (2005). Функциональная избыточность белков PIN сопровождается ауксин-зависимой перекрестной регуляцией экспрессии PIN. Развитие 132, 4521–4531. DOI: 10.1242 / dev.02027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Vissenberg, K., Claeijs, N., Balcerowicz, D., and Schoenaers, S. (2020). Гормональная регуляция роста корневых волосков и реакция на окружающую среду в Arabidopsis . J. Exp. Бот. 71, 2412–2427. DOI: 10.1093 / jxb / eraa048

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wabnik, K., Govaerts, W., Friml, J., and Kleine-Vehn, J. (2011). Модели обратной связи для поляризованного транспорта ауксина: новая тенденция. Мол. Bio Syst. 7, 2352–2359. DOI: 10.1039 / c1mb05109a

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Винтер, Д., Уксус, Б., Нахал, Х., Аммар, Р., Уилсон, Г. В., и Проварт, Н.Дж. (2007). Браузер «Электронная флуоресцентная пиктограмма» для изучения и анализа крупномасштабных наборов биологических данных. PLoS One 2: e718. DOI: 10.1371 / journal.pone.0000718

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Витц, С., Юнг, Б., Фюрст, С., и Мёльманн, Т. (2012). Синтез пиримидиновых нуклеотидов de novo в основном происходит вне пластид, но ранее неизвестный импортер азотистых оснований обеспечивает субстраты для важного пути спасения в Arabidopsis . Растительная клетка 24, 1549–1559. DOI: 10.1105 / tpc.112.096743

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зреннер Р., Ститт М., Зонневальд У. и Болдт Р. (2006). Биосинтез и разложение пиримидинов и пуринов в растениях. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 805–836. DOI: 10.1146 / annurev.arplant.57.032905.105421

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

CTP и DCI: нам нужны разъяснения

Работа Мерфи и др. «Изменения перфузии головного мозга при индуцированной гипертензии при аневризматическом субарахноидальном кровоизлиянии: экспериментальное и технико-экономическое обоснование».[1] представляет собой ретроспективное исследование полезности перфузии при компьютерной томографии (CTP) до и после лечения отсроченной клинической ишемии (DCI) через индуцированную гипертензию (IH). Эта работа основана на обширной истории лечения DCI с использованием «тройной H-терапии» с применением эффективного и широко доступного метода измерения мозгового кровотока. Литература, рассмотренная в этой статье, отражает текущий конфликт в отношении лечения DCI: а именно, DCI связана с худшими результатами после субарахноидального кровоизлияния (SAH), но лечение DCI не показало улучшения результатов.

Это исследование представляет собой прагматический ретроспективный взгляд на реальную службу SAH. Пациенты получали CTP вскоре после прибытия, а затем снова в период, когда наиболее вероятно появление DCI. Из трех измерений, полученных в CTP, наиболее полезным является среднее время прохождения (MTT). Фактически, существует прогностический эффект пролонгированного МТТ на раннюю CTP для более позднего DCI. В группе DCI MTT значительно снижается после учреждения IH. Однако не было разницы в отношении инфаркта или неблагоприятного исхода по сравнению с группой, в которой не развился DCI.

Терапия «тройной Н» для лечения DCI включает гиперволемию, гипертензию и гемодилюцию. Растущее признание осложнений терапии «тройным Н» привело к новой оценке роли каждого из трех компонентов. В результате 2 из 3 «H» потеряли значение, оставив индуцированную гипертензию в качестве основы лечения DCI [2]. Терапия «Triple H» оценивалась и как лечение, и как профилактика DCI, но без единого мнения [3]. Настоящая статья посвящена этому центральному вопросу.По замыслу, IH в этой статье — это «лечение» клинической DCI. Однако обнаружение раннего удлинения МТТ задолго до развития симптомов повышает вероятность того, что IH может играть роль в «профилактике» DCI, а также в лечении. Возможно, артериальная гипертензия играет определенную роль сразу после того, как аневризма зафиксирована, и ее можно оценить с помощью CTP.

Хотя DCI является ведущей причиной смерти и инвалидности при лечении аневризматической САК, использование «тройного H» не обязательно дает лучшие результаты.Неясно, что именно меняется в физиологии аневризматической САК при «лечении» DCI. Интуитивно кажется, что это изменение мозгового кровотока (CBF). Многие методы, включая ПЭТ, ОФЭКТ, МРТ, а теперь и КТР, пытались идентифицировать эту сигнатуру [4]. CTP, с его практическими преимуществами, заключающимися в широкой доступности и быстром приобретении, в последнее время привлекает больше внимания с неоднозначными результатами [5, 6]. Мерфи и др. указывают, что CBF может быть неправильной подписью. Похоже, что MTT, а не CBF, является ключевым компонентом как для выявления тех, кто с большей вероятностью разовьет DCI, так и для мониторинга эффекта лечения.Авторам удалось продемонстрировать значительные изменения при использовании МТТ у одной десятой пациентов, которые считались необходимыми для исследования ИГ, если кто-то ищет изменения в CBF [7].

В этой статье, как и в других, не было обнаружено клинических различий в когортах DCI и не-DCI. Это может быть просто потому, что IH улучшил результаты в когорте DCI по сравнению с когортой без DCI. Авторы заявляют, что рандомизация пациентов с DCI на лечение IH неэтична в их учреждении. Они также приводят все больше доказательств как вреда, так и отсутствия клинической эффективности текущей терапии DCI.Следовательно, клиницисты этически обязаны объективно оценивать лечение (или профилактику) DCI, как и любую другую терапию. Рандомизированное исследование (HIMALAIA) для оценки IH при DCI недавно завершилось из-за отсутствия набора, но это не должно быть последним словом по теме [8]. Я надеюсь, что эта статья, с ее результатами MTT как чувствительной меры как для отбора пациентов, так и для оценки терапевтического ответа, послужит вдохновением для дальнейшего изучения этого вопроса.

Ссылки

1. 1.

   Мерфи А., де Оливейра Маноэль А.Л., Макдональд Р.Л. и др. Изменения церебральной перфузии при индуцированной гипертензии при аневризматическом субарахноидальном кровоизлиянии: экспериментальное и технико-экономическое обоснование. Neurocrit Care. 2017 ;. DOI: 10.1007 / s12028-017-0379-6.

   PubMed Google ученый

2. 2.

   Treggiari MM, Deem S. Какой H является наиболее важным в терапии тройным H при церебральном вазоспазме? Curr Opin Crit Care. 2009. 15 (2): 83–6.

   Артикул PubMed Google ученый

3. 3.

   Dankbaar JW, Slooter AJ, Rinkel GJ и др. Влияние различных компонентов терапии Triple-H на перфузию головного мозга у пациентов с аневризматическим субарахноидальным кровоизлиянием: систематический обзор. Crit Care. 2010; 14: R23.

   Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

4. 4.

   Keyrouz SG, Diringer MN. Клинический обзор: профилактика и терапия спазма сосудов при субарахноидальном кровоизлиянии. Crit Care. 2007; 11: 220.

   Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

5. 5.

   Мир Д.И., Гупта А., Даннинг А. и др. КТ-перфузия для обнаружения отсроченной ишемии головного мозга при аневризматическом субарахноидальном кровоизлиянии: систематический обзор и метаанализ. AJNR Am J Neuroradiol. 2014; 35: 866–71.

   CAS Статья PubMed Google ученый

6. 6.

   Cremers CH, van der Schaaf IC, Wensink E, et al. КТ-перфузия и отсроченная церебральная ишемия при аневризматическом субарахноидальном кровоизлиянии: систематический обзор и метаанализ.J Cereb Blood Flow Metab. 2014; 34: 200–7.

   Артикул PubMed Google ученый

7. 7.

   Gathier CS, Dankbaar JW, van der Jagt M, et al. Влияние индуцированной гипертензии на перфузию головного мозга при отсроченной ишемии головного мозга после аневризматического субарахноидального кровоизлияния: рандомизированное клиническое исследование. Инсульт. 2015; 46: 327–81.

   Артикул Google ученый

8. 8.

   Gathier CS, van den Bergh WM, Slooter AJ, et al.HIMALAIA (Индукция гипертензии при лечении аневризмы субарахноидального кровотечения с вторичной ишемией A): рандомизированное слепое контролируемое исследование индуцированной гипертензии в сравнении с отсутствием индуцированной гипертензии при лечении отсроченной церебральной ишемии. Int J Stroke. 2014; 9: 375–80.

   CAS Статья PubMed Google ученый

Скачать ссылки

Информация об авторе

Принадлежности

1. Neurosurgical Associates, Больница Джонстон Уиллис, Ричмонд, штат Вирджиния, США

   Томас Маттингли

Автор, ответственный за письмо

Переписка с Томас Маттингли.

Об этой статье

Цитируйте эту статью

Mattingly, T. CTP и DCI: нам нужны разъяснения. Neurocrit Care 27, 1-2 (2017). https://doi.org/10.1007/s12028-017-0434-3

Ссылка для скачивания

Поделиться этой статьей

Все, с кем вы поделитесь следующей ссылкой, смогут прочитать это содержание:

Получить ссылку для совместного использования

Извините, Ссылка для совместного использования в настоящее время недоступна для этой статьи.

Предоставлено инициативой по обмену контентом Springer Nature SharedIt

Терапевтический потенциал опосредованного аденовирусом пептида TFF2-CTP-Flag для лечения колоректального рака

Мышей

Мышей дикого типа C57 / BL6 были приобретены в Jackson Laboratories (Бар-Харбор, штат Мэн), Tff2 -null и CD2 — Tff2 мышей, обе на фоне C57BL / 6, были получены ранее в нашей лаборатории и описаны ранее [1, 9].Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения по исследованиям на животных и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Колумбийского университета. Мышей содержали в специальных помещениях, свободных от патогенов.

Индукция колита

В экспериментах с DSS-индуцированным колитом 8-12-недельным мышам Tff2-null и мышам дикого типа соответствующего пола давали 2,5% DSS (м / м 36 000–50 000; MP Biomedicals , Солон, Огайо, США), растворенный в питьевой воде ad libitum в течение 5 дней, а затем в обычной воде в течение следующих 14 дней.Мышей анализировали на 19 день.

Модель опухоли

Мышам (возраст 7-8 недель) внутрибрюшинно вводили АОМ (10 мг кг массы тела ^-1 ) и через одну неделю давали 2,5% воды DSS в течение 7 дней. Через четыре недели мышей обрабатывали одной дозой 5 × 10 ⁸ БОЕ на мышь Ad- Tff2 -CTP-Flag (или Ad- Tff2 ) и Ad-Fc-CTP-Flag (или Ad-Fc). каждые две недели путем инъекции в хвост в течение 12 недель и анализируется через 4 недели после первой инъекции. Подсчитывали макроскопически видимые опухоли.

Препарат аденовируса Ad-

Tff2 -CTP для экспрессии мышиного TFF2-CTP-Flag

Аденовирусный вектор GV314 (pDC315-3FLAG-sv40-EGFP) был использован в этом исследовании для приготовления конструкции, кодирующей слияние TFF2-CTP- Флаг. Полноразмерную открытую рамку считывания TFF2 мыши вставляли в аденовирусный вектор GV314 с использованием сайтов BamHI / AgeI в рамке слияния с 3 × Flag, которая впоследствии была упакована в аденовирус. Конструкцию pDC315-Fc-3FLAG-sv40-EGFP (Ad-Fc-CTP), кодирующую Fc-фрагмент человеческого IgG, использовали в качестве отрицательного контроля.Оба вектора были приобретены у Genechem Incorporation (Шанхай, Китай). Рекомбинантные аденовирусы размножали с клетками HEK293 и очищали с помощью двух циклов ультрацентрифугирования в градиенте CsCl и титровали методом TCID50. Аденовирус хранили при -80 ° C в буфере для хранения (10 мМ Трис, 2 мМ MgCl ₂ , 10% глицерин, pH 7,5).

Клонирование, вирусное производство и очистка рекомбинантного слитого белка TFF2-CTP-Flag

Клонирование

Мышиный фрагмент ДНК TFF2-2xCTP-3xFlag синтезировали с использованием Gblock (Integrated DNA Technologies) с сайтами вырезания Not1 и Bamh2.Эту вставку клонировали в вектор Daedalus [10] с помощью клонирования in-fusion (Clontech). Лентивирус был создан в более крупном масштабе с использованием пробирок TPP. Вкратце, 2 × 10 ⁷ клеток Freestyle 293-F в 10 мл свежей среды Freestyle (Invitrogen) добавляли в каждую пробирку TPP (Midsci). Эти клетки трансфицировали смесью ДНК (8 мкг psPAX2, 4 мкг PMD2.G (Addgene) и 16 мкг вектора Daedalus) и 30 мкл (при 1 мкг / мл) PEI. Через 4-6 часов после трансфекции в пробирку TPP добавляли 10 мл свежей среды.Затем через 24 часа после трансфекции в пробирку TPP добавляли вальпроевую кислоту до конечной концентрации 3 мМ вместе с 10 мл свежей среды. Пробирки инкубировали в шейкере Kuhner, 37 ° C, 8% CO ₂ , 210 об / мин в течение 72 часов перед сбором вируса из супернатанта. Этот титр вируса рассчитывали и хранили при 4 ° C до стадии трансдукции.

Продукция вируса

1 × 10 ⁷ Клетки Freestyle 293-F в 5 мл свежей среды Freestyle добавляли во встряхиваемую колбу объемом 125 мл (Fisher Scientific), затем добавляли достаточное количество вируса для трансдукции при MOI ~ 10, как определено на этапе титра вируса, а конечный объем доводили до 20 мл с помощью питательной среды.Клетки инкубировали в шейкер-инкубаторе Kuhner при 37 ° C, 8% CO ₂ , 110 об / мин в течение 4–6 часов перед добавлением 15 мл свежей среды. После 3 дней инкубации в шейкере-инкубаторе эффективность трансдукции оценивали с помощью проточной цитометрии (с использованием репортера GFP). Клетки, показывающие ~ 99% трансдукции, были увеличены до производственных объемов с помощью раундов разбавления / увеличения до необходимого объема.

Очистка

Супернатант собирали центрифугированием при 500 × g в течение 15 мин при 4 ° C.Суп пропускали через фильтр 0,45 мкм для удаления любых оставшихся остатков клеток. Затем суп концентрировали до 1/10 начального объема с использованием кассет vivaflow 50 с отсечкой 5000 Да (Sartorius). Затем концентрированный суп разбавляли в десять раз, используя буфер для уравновешивания (20 мМ трис-HCl, 20 мМ NaCl, pH 8,0). Слитый белок TFF2-CTP-Flag из этого разбавленного супа очищали с помощью анионообменной хроматографии (Capto Q, GE Life Sciences). Связанный белок элюировали с использованием солевого градиента через буфер для элюции (20 мМ Трис-HCl, 1 М NaCl, pH 8.0). Затем элюат концентрировали, фильтровали и наносили на эксклюзионную хроматографию (колонка HiLoad 26/600 Superdex 200 пг, GE Healthcare, England), уравновешенную буфером DPBS. Фракции, содержащие слитый белок TFF2-CTP-Flag, объединяли, концентрировали, фильтровали и проверяли на уровни эндотоксина (Kinetic-QCL ^™ Kinetic Chromogenic LAL Assay, Lonza).

Введение и сбор крови TFF2

Рекомбинантный TFF2 дикого типа очищали до гомогенности, как описано ранее [11], и вводили в дозе 5 мг / кг ^-1 массы тела (416 мкМ кг ^-1 ).Кажущаяся молекулярная масса рекомбинантного слияния TFF2-CTP-Flag составляла около 38 кДа из-за высокого уровня гликозилирования в клетках HEK293. Сравнение удерживания TFF2 и TFF2-CTP-Flag в крови было основано на эквимолярной концентрации и рассчитано на основе их кажущейся молекулярной массы, определенной с помощью вестерн-блоттинга. Для взятия крови использовался комбинированный забор крови. Образцы крови собирали через 0, 0,5, 1, 2 и 3 часа после инъекции.

Тест in vitro рекомбинантного слияния TFF2-CTP-flag, продуцируемого клетками Freestyle 293-F, по сравнению с TFF2

Сравнение активности рекомбинантного слияния TFF2-CTP-Flag, продуцируемого Freestyle 293-F, с TFF2 дикого типа vitro тест с клетками CD11b ⁺ Gr1 ⁺ . Tff2 -нулевым мышам давали 2,5% DSS-воду в течение 5 дней подряд, а затем мышам давали обычную водопроводную воду в течение 14 дней. На 19 день после начала лечения мышей умерщвляли и отсортировывали CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ из селезенки. Клетки CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ (8 × 10 ⁵ на лунку) культивировали 7 дней в среде DMEM с 10% FBS и 2,5 нг мл ^-1 GM-CSF в присутствии диких — типа TFF2 и слияния TFF2-CTP-Flag в указанных концентрациях, затем выделяли общую мРНК и измеряли мРНК циклина D1.

Вестерн-блот-анализ

Для вестерн-блот-анализа 5 мкл сыворотки (или мочи, если указано) были разделены с использованием предварительно отлитых 10-20% SDS-полиакриламидных гелей (Bio-Rad) и перенесены на PVDF-мембрану Immobilon-P (0,22 мкм, Millipore). Все блоты блокировали 5% обезжиренным молоком в трис-буферном физиологическом растворе (TBS) плюс Твин 20 (0,05%) в течение 1 часа. Аффинно очищенные первичные поликлональные кроличьи антитела получали против С-конца мышиного TFF2 (пептид Новой Англии) и использовали в концентрации 1 мкг / мл ^-1 .Антитело Anti-Flag (Cell Signaling) использовали в разведении 1: 2000. Блоты были разработаны с использованием субстрата для вестерн-блоттинга Pierce ECL Plus (Pierce ECL).

RT-PCR

Образцы печени помещали в стабилизирующий раствор RNAlater (Ambion) и хранили при -80 ° C до использования. Общую мРНК выделяли с использованием набора NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel) в соответствии с инструкциями производителя. Количество РНК оценивали с помощью NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). кДНК синтезировали из 1 мкг тотальной РНК в объеме 20 мкл с использованием случайных гексамерных праймеров с набором для синтеза первой цепи кДНК (Invitrogen, Carlsbad, USA).Амплификации проводили с общим объемом 20 мкл с TaqMan Universal PCR Master mix и следующими праймерами: TFF2 (Mm.PT.58.10220652 / 56-FAM / AC TCT CAG T / Zen / A GTG ACA ATC TTC CAC AGA CT / 3IABkFQ ) и эталонный ген Hprt (Mm.RT.39a.22214828 / 56-FAM / CT TGC TGG T / Zen / G AAA AGG ACC TCT CGA A / 3IABkFQ).

Связанный с клеточным циклом ген циклин D1 был протестирован с использованием мышиных праймеров для циклина D1 (прямой) 5′-GCGTACCCTGACACCAATCTCC-3 ‘, (обратный) 5′-CCTCTTCGCACTTCTGCTCCTC-3′, контрольный мышиный ген GAPDH (вперед) (5’- ACGGACCCCAAAAGATGAAG-3 ‘; (обратная сторона) 5′-TTCTCCACAGCCACAATGAG-3’ и PowerUp ™ SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems).Анализы выполняли на термоциклере ABI 7500 (Applied Biosystem). Все определения были выполнены в трех технических повторностях. Относительную численность каждой мРНК рассчитывали методом ΔΔ C _T , нормализовав экспрессию гена домашней прислуги со стандартизацией для одного контрольного образца.

Статистический анализ

Графики и анализы были рассчитаны с использованием Prism 6.0 для Mac OSX (программное обеспечение GraphPad, Inc) и Excel. Либо двусторонний критерий Стьюдента t , либо односторонний дисперсионный анализ ANOVA использовался для оценки значимости между двумя группами для параметрических и непараметрических данных, соответственно.Для всех цифр применимы следующие обозначения: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. p -значения <0,05 считались значимыми. Данные были выражены как средние значения ± стандартное отклонение среднего.

Проверка лицензии иностранного пилота

Многие иностранные студенты уже получили лицензию пилота в своих странах, прежде чем перейти в Epic для продолжения обучения в качестве пилота коммерческой авиации. Эти студенты должны заполнить форму проверки подлинности иностранной лицензии и медицинского свидетельства, как того требует Федеральное управление гражданской авиации, чтобы продолжить обучение в Epic.Независимо от объема обучения, полученного за пределами США, студенты могут перейти только на максимальное количество частных пилотов FAA. Процесс проверки лицензии иностранного пилота может занять до 90 дней, поэтому учащимся необходимо заранее планировать, проявлять инициативу и предоставлять необходимую документацию до прибытия в Epic.

Примечание. Если у вас есть какие-либо ограничения на вашу лицензию, немедленно сообщите об этом Допуску до начала процесса проверки лицензии иностранного пилота.

Первый шаг для проверки лицензии иностранного пилота:

Отправьте подтверждающие документы в FAA

1) Включите увеличенную копию лицензии частного пилота

2) Включите увеличенную копию медицинского свидетельства

3) Завершено Форма и загрузка документов в IACRA в электронном виде (предпочтительно):

IACRA

Или, после заполнения онлайн-формы, отправьте увеличенную копию вашей лицензии частного иностранного пилота и увеличенную копию вашего медицинского свидетельства на номер:

FAA / Отдел сертификации пилотов
PO Box 25082
Oklahoma City, OK 73125-0082

ПРИМЕЧАНИЕ: Если какие-либо документы неразборчивы, FAA остановит процесс и свяжется со студентом по электронной почте для повторной подачи четких документов в течение 30 дней. дней.Если студент не отвечает, запрос на преобразование иностранной лицензии отменяется.

Следующие шаги для проверки:

Подтвердите запрос на проверку в вашем ведомстве гражданской авиации

Позвоните в отдел гражданской авиации вашей страны, чтобы убедиться, что запрос был получен и обработан. Если ваша страна не ответит на запрос FAA о проверке, FAA будет повторно отправлять запрос каждые 30 дней, 4 раза. Если проверка не будет завершена, запрос будет отменен.

Получить письмо о подлинности и медицинское свидетельство FAA

В случае одобрения вы получите письмо о подлинности от FAA, которое дает вам право на получение временного сертификата. Затем вы должны пройти медицинское обследование, которое позволит вам получить медицинский сертификат FAA по прибытии в США.

Прибытие в Epic и завершение регистрации в IACRA

• Зарегистрируйтесь в IACRA, используя точное имя, указанное в Письме о подлинности, который должен соответствовать вашему паспорту.Примечание. Если срок действия вашего иностранного медицинского учреждения истек или имя, указанное в письме о подлинности, не соответствует вашему паспорту, НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ IACRA. Вам необходимо использовать ACRA — программу на жестком диске, расположенном в тестовой комнате экзаменатора.
• Заполните все 6 шагов в IACRA.
• На Шаге 6 «Соло» означает единоличное лицо, находящееся в воздушном судне, а «PIC» означает индивидуальное время плюс все остальное время PIC.

Получите сертификат пилота США

Вы можете бесплатно получить временный сертификат в Orlando MCO FSDO.Кроме того, вы можете встретиться с Филлис в Epic, чтобы назначить утвержденного уполномоченного экзаменатора (DE), который придет непосредственно в Epic и создаст временный сертификат. Стоимость этого составляет 150 долларов США, только наличными, выплачиваются непосредственно в DE. Независимо от вашего выбора, вы должны предоставить следующие документы:

• Регистрация в IACRA
• Подтверждение подлинности FAA
• 2 копии паспорта
• Журнал пилота
• 2 копии лицензии иностранного пилота
• 2 копии медицинского сертификата FAA

Информация об истечении срока действия

*** Письмо о подлинности действительно только в течение 6 месяцев *** Если вы должны остаться более 6 месяцев, вы должны повторно подать заявление за 2 месяца до истечения срока его действия.Многие студенты забывают эту информацию и не могут пройти контрольную, потому что срок действия их письма о подлинности истек. Если возникнет необходимость повторно подать заявку на Письмо о подлинности, этот же процесс необходимо повторить. Однако мы обнаруживаем, что во второй раз это происходит быстрее.

Вопросы? Электронная почта Student Service

Дополнительные требования для определенных стран

Некоторые CAA требуют, чтобы вы связались с ними для предоставления дополнительной информации. Это требуется ДО , когда вы отправите другую информацию и документы в IACRA.Страны, которые требуют, чтобы вы связались с их соответствующими CAA: Австралия , Cypress , Ирландия , Малайзия , Новая Зеландия и Великобритания . Вы можете получить доступ к их CAA ниже:

Австралия CAA

Cypress CAA

Ирландия CAA

Малайзия CAA

Новая Зеландия CAA

Соединенное Королевство CAA

Требования к частному пилоту FAA

Примечание: Раздел 61 FAA.109 перечисляет следующие требования к опыту авиации для лицензии частного пилота:

(a) Для однодвигательного самолета. За исключением случаев, предусмотренных в пункте (k) этого раздела, лицо, подающее заявление на получение сертификата частного пилота с категорией самолета и рейтингом одномоторного класса, должно налетать не менее 40 часов, включая не менее 20 часов летной подготовки с уполномоченный инструктор и 10 часов самостоятельных летных тренировок в областях деятельности, перечисленных в § 61.107 (b) (1) этой части, и обучение должно включать не менее —

(1) 3 часа обучения полетам по пересеченной местности на одномоторном самолете;

(2) За исключением случаев, предусмотренных в § 61.110 этой части, 3 часа ночной подготовки к полетам на одномоторном самолете, что включает:

(i) Один полет по пересеченной местности на общую протяженность более 100 морских миль; и

(ii) 10 взлетов и 10 посадок до полной остановки (каждая посадка связана с полетом в схеме движения) в аэропорту.

(3) 3 часа летной подготовки на одномоторном самолете по управлению и маневрированию самолета исключительно по приборам, включая прямой и горизонтальный полет, набор высоты и снижение с постоянной воздушной скоростью, развороты на курс, выход из необычного положение в полете, радиосвязь и использование навигационных систем / средств и радиолокационных служб, соответствующих полету по приборам;

(4) 3 часа летной подготовки с уполномоченным инструктором на одномоторном самолете в рамках подготовки к практическому экзамену, который должен быть проведен в течение предшествующих 2 календарных месяцев, начиная с месяца тестирования; и

(5) 10 часов самостоятельного полета на одномоторном самолете, включая не менее —

(i) 5 часов автономного полета по пересеченной местности;

(ii) Один одиночный полет по пересеченной местности общей протяженностью 150 морских миль с полной остановкой в ​​трех точках и один сегмент полета, состоящий из расстояния более 50 морских миль по прямой между взлетом и посадкой. локации; и

(iii) три взлета и три посадки до полной остановки (каждая посадка связана с полетом в схеме движения) в аэропорту с действующей диспетчерской вышкой.

Чтобы напрямую связаться с отделом информации и поддержки FAA по сертификации пилотов для проверки лицензии иностранного пилота, студенты могут позвонить по телефону: + 1-405-954-3261. Не стесняйтесь обращаться к нашей приемной комиссии Epic, если у вас есть какие-либо вопросы!

Хотите узнать больше об Epic Flight Academy? Свяжитесь с нами прямо сейчас! Мы здесь, чтобы ответить на любые вопросы и помочь вам начать работу!

Amazon.com: CTP Certified Treasury Professional Online Certification Простое видеообучение: фильмы и ТВ

Высокий показатель успеха.Доверьте нам лучшие результаты по лучшей цене. ИТ-сертификации стало проще благодаря точным и актуальным вопросам. Расширьте свою квалификацию с помощью нашего удобного для пользователя самостоятельного экзамена. Подготовьтесь к сертификационным экзаменам с помощью вопросов и ответов в режиме реального времени, проверенных опытными профессионалами! Мы упростим вам процесс сертификации, поскольку предоставим вам учебные материалы, которые помогут вам сдать экзамены с первого раза. Наши подготовительные материалы, профессионально исследованные сертифицированными инструкторами, соответствуют наивысшим 99 отраслевым показателям.6% проходной балл среди наших клиентов. Как и все наши экзамены. Real IT Exam Вопросы и ответы. Полный набор от 80 до 350 общего количества вопросов и ответов (минимальное количество вопросов должно быть 80, а максимальное может доходить до 350 количества вопросов, (будет дана видеосессия всех вопросов и ответов). PPT в формате PDF будет предоставлен формат, который может быть распечатан для проверки ваших знаний перед сдачей настоящего экзамена.Набор вопросов и ответов будет предоставлен для практики, аналогичной той, которую вы получите на экзамене в реальном времени.Профессиональные эксперты и компания рекомендуют сочетать учебные курсы и практический опыт для подготовки к сертификационному экзамену, поскольку вопросы будут проверять вашу способность применять знания, полученные в ходе обучения. Три образца резюме будут предоставлены для более свежих, со средним опытом и соискателям опыта продвинутого уровня. 60 дней бесплатных обновлений 10 лет в бизнесе, более 414952 довольных клиентов. Удивительная процентная ставка сдачи экзаменов 99,6%. Присоединяйтесь к нашему успеху! Обратите внимание: этот товар не подлежит возврату; этот продукт полностью посвящен только этой подготовке к сертификации.Мы не продаем никаких других учебных материалов, кроме практических вопросов и ответов вместе с образцами резюме. Продукт полностью аутентичен и зарегистрирован под нашей торговой маркой BrainITworks. Перед покупкой попросите пояснить подлинность этого продукта.

утвержденных дампов ОСАГО PDF Вопросы [2021]

Прогресс в технологиях фактов неизбежен, и чтобы не отставать от темпов изменений, специалисты по сертификации AFP хотят получить вопросы Authentic CTP Dumps PDF для подготовки вопросов экзамена Certified Treasury Professional для развития своей профессии в области ИТ.Таким образом, чтобы помочь вам во всем этом аспекте, мы рекомендуем вам пройти экзамен AFP CTP, который дает ответы на вопросы, чтобы идти в ногу со всеми постоянно меняющимися технологиями в деталях, передавая новые вопросы CTP.

Итак, если вы хотите сдать сертификационный экзамен AFP CTP, вы можете найти некоторые элементы, которые необходимо рассмотреть непосредственно перед тем, как выбрать вопросы экзамена Certified Treasury Professional. По сути, наиболее важным будет получение подлинных дампов CTP вопросов в формате pdf с проверенными ответами, предлагаемыми CertsMate, которые могут помочь вам с легкостью понять темы вопросов сертифицированного казначейства.Таким образом, с помощью дампов экзаменов CTP и полезных рекомендаций у вас будет возможность подготовить и сдать новые вопросы CTP в рамках первоначальной попытки с идеальными оценками.

Как подготовиться к экзамену AFP CTP Вопросы?

Прежде всего вы должны собрать каждую силу воли, чтобы подготовиться к вопросам экзамена AFP CTP, потому что сертификационный экзамен AFP CTP — нелегкая работа, которую вы можете быстро получить. Так что, если вы определенно хотите пройти вопросы Сертифицированного казначейского профессионала, вам обязательно нужно принять во внимание получение новых дампов CTP вопросов в формате pdf для подготовки новых вопросов CTP.Поскольку AFP CTP Exam Questions — непростой процесс, от которого каждый может легко избавиться от получения дампа CTP в формате pdf.

Вот почему выбор утвержденных вопросов в формате PDF для дампа CTP необходим как способ успешно сдать экзамены на сертифицированного казначейского профессионала. Мало того, что вы также можете получить возможность провести самооценку непосредственно перед тем, как приступить к ответам на актуальные вопросы Certified Treasury Professional, и это может быть выполнено вместе с поддержкой приложения для практического тестирования CTP и с помощью веб-тестовой системы. .Так что получите дампы CTP pdf и практические тесты, чтобы эффективно выполнять сертификационный экзамен AFP Certification CTP.

Дампы экзаменов AFP CTP, предоставленные CertsMate

Насколько мы понимаем, вы не можете получить правильное время для подготовки к вопросам экзамена AFP CTP из-за вашего напряженного графика. Но знаете что? У нас есть великолепные свалки вопросов экзамена CTP с проверенными ответами, которые могут облегчить подготовку к вопросам сертифицированного казначейского профессионала даже в вашей повседневной жизни.Вы можете получить доступ к этим утвержденным pdf-вопросам дампов CTP в любое время, когда захотите. Потому что вы можете получить дампы CTP pdf в формате PDF. Это также можно практиковать на любом устройстве и платформе.

Самое главное, что вы также можете загрузить демо-версию новых дампов CTP в формате pdf, которые могут облегчить понимание хорошего качества дампов экзаменов CTP даже до фактической покупки дампов CTP в формате pdf. Кроме того, практический тест CTP может помочь вам понять слабые темы, которые вам просто нужно практиковать гораздо больше, чтобы получить достижения в новых вопросах CTP.

Гарантия возврата денег для подлинных дампов CTP Вопросы в формате PDF

Вы также можете получить утвержденные вопросы и ответы в формате PDF с утвержденными дампами CTP, используя полную 100% гарантию прохождения и возврата денег. Беспокойство о неудаче исчезнет с этим экзаменом AFP CTP, который дает уверенность в прохождении. Кроме того, круглосуточная поддержка клиентов на дампах CTP в формате pdf значительно упрощает подготовку и сдачу вопросов для сертифицированного казначейского профессионала благодаря правильному выполнению экзамена CTP для получения хороших результатов.

Чтобы отслеживать все изменения в предметах и ​​программе сертификационного экзамена Certified Treasury Professional, вы получите дампы CTP в формате pdf с бесплатными обновлениями в общей сложности за три месяца. Эти совершенно бесплатные обновления с дампами экзаменов CTP могут помочь вам справиться со всеми изменениями в вопросах экзамена Certified Treasury Professional. Короче говоря, подлинные вопросы и ответы CertsMate дампов CTP в формате pdf будут подтверждены, чтобы стать идеальным источником для подготовки вопросов экзамена CTP.

---

Свалки экзаменов CTP | CTP PDF дампы | CTP PDF Вопросы | CTP BrainDumps | Практический тест ОСАГО | Сертифицированные профессиональные вопросы казначейства с проверенными ответами | Программное обеспечение для сертификационных испытаний AFP | Практические вопросы CTP

дампов CTP [2019] — Настоящий вопрос о проверке CTP — добро пожаловать.

На случай, если вы ответите на вопросы CTP Dumps, вопросы и хотите получить аутентичные дампы экзаменов CTP в внешний… В этот момент вы, безусловно, должны понять, что находитесь на оптимальном пути к хорошим результатам в новых запросах CTP. В случае, если вы находитесь в рамках запроса о существенных дампах AFP CTP pdf с проверенными ответами специалистов AFP, тогда вы должны понимать, что в целом делает адреса дампов CTP надежными и продуктивными? Эти вопросы AFP CTP дампов в формате pdf также сопровождают 100% проходную гарантию, которая создаст основу для дампов подтверждений экзаменов CTP Certification CTP, и вы будете оснащены для того, чтобы без проблем пройти запросы дампов дампов профессиональных экзаменов сертифицированного казначейства.

На что обращать внимание при выборе дампов экзаменов CTP?

С конечной целью иметь подтвержденные дампы CTP pdf, вам следует разобраться с несколькими проблемами. Абсолютно, прежде всего, вы должны знать правдоподобие подлинных AFP Dumps Questions CTP Dumps pdf Questions на внешний. скачав демо-адаптацию в дампах CTP pdf. На этом этапе вы должны перейти к другой схеме CTP Exam Dumps, когда сцена рекламируется. На случай, если это не так, в этот момент сцена уже не будет вам полезна.На этом этапе вы должны подтвердить, что AFP CTP pdf выгружает дань. Принятие участия в дампах CTP в виде схемы адресов в формате PDF поможет вам получить идеальный взгляд на их запросы в формате PDF для сертифицированных специалистов по финансам, полученные от их предыдущего клиента по дампам экзаменов CTP. На этом этапе вы должны выбрать различные основные моменты из одобренного PDF-файла дампа CTP.

Prophet Cloud Solutions Infrastructure CTP Dumps Вопросы CertsZone

Новые адреса CTP Exam Dumps, указанные в названии, соответствуют ранее упомянутым качествам, как и некоторые другие примечательные особенности.Можно загрузить демонстрационный вариант дампов экзаменов CTP, прежде чем вы его получите. Вы также можете получить подтвержденные документы в формате PDF в формате CTP, которые могут не только помочь вам в изучении вашей основы для создания PDF-файлов сертифицированных специалистов по казначейству, но и дадут вам возможность ознакомиться с подлинными сертификатами AFP в формате PDF.

100% гарантия возврата денег на дампы AFP CTP PDF

Так же, как и у Braindumps есть возможность получить дампы AFP CTP pdf, используя 100% безусловное обещание.У вас также будет возможность получать запросы к дампам экзаменов AFP CTP с ежедневной круглосуточной поддержкой клиентов. Это поможет вам полностью очистить ваши вопросы, касающиеся новых дампов CTP pdf, на тот случай, если у вас есть такая возможность. CertsZone на внешний. продолжает обновлять запросы практики CTP Exam Dumps согласно предварительным требованиям, и вы можете получить эти обновления бесплатно в течение 90 дней. Получите AFP Exam Dumps CTP dumps pdf из CertsZone и присоединитесь к семье более

оптимистичных клиентов вскоре после прохождения новых запросов CTP.

Экзамен ОСАГО | Вопросы по экзамену CTP | CTP-дампы pdf PDF Вопросы 2020 | CTP PDF дампы | Свалки экзаменов CTP | Дампы ОСАГО pdf | Вопросы ОСАГО | CTP PDF Вопросы | Практический экзамен CTP | PDF Dumps практический экзамен | CTP Braindumps | Вопросы по CTP | PDF Дампы вопросов и экзаменационный движок | Практический экзамен CTP | PDF дамп вопросов с проверенными ответами | Повышение квалификации до сертифицированного профессионала казначейства Вопросы PDF

Ссылки по теме

.