|
Ксения Борисовна Кепинг (07.02.1937 13.12.2002) — человек необычной судьбы. Одного взгляда на ее паспорт было достаточно, чтобы удивиться: русское имя, шведская фамилия, место рождения Тяньцзин (Китай), — и фотография красивой блондинки.
Она умела удивлять. Будучи всемирно
известным специалистом в области тангутского языкознания, Ксения Борисовна
в последние годы стала отходить от этого направления, заинтересовалась
культурой и историей государства Тангутов. Глубокие познания и интуиция
ученого позволили ей в короткий срок написать серию статей, посвященных
новой тематике. Большинство ее коллег даже не успели заметить перемен,
некоторые недоумевали: зачем? И лишь очень немногие оценили оригинальность
ее взглядов. То, что племянница последнего начальника Русской Духовной миссии в Китае архиепископа Виктора (Святина), обратилась к истории Миссии, закономерно. Но удивляло, как и что она писала (впрочем, то, что она говорила, удивляло еще больше). Ксении Борисовне не хватило времени написать задуманную книгу о тангутской культуре, закончить сценарий фильма о Чингис-Хане, она не успела записать свои воспоминания. В настоящий сборник вошли как опубликованные, так и неопубликованные статьи последних лет, написанные на английском и русском языках, библиография работ К.Б.Кепинг, документы и фотографии из ее личного архива. |
This
website is an electronic version of the book
Ксения Кепинг. Последние статьи и документы
(Ksenia
Kepping. |
Last Works аnd Documents), published 2003 in St-Petersburg,
Russia.
The book
is a tribute to the memory of Dr. Ksenia Kepping. It contains previously
published and non-published articles and extracts written in English and
Russian, a bibliography of Dr. Kepping’s works, along with records and
photographs from her personal archives.Кепинг О. В. Последний начальник Российской Духовной Миссии в Китае — архиепископ Виктор: жизненный путь, Православие на Дальнем Востоке.
Выпуск I: 275-летие Российской Духовной миссии в КитаеМ.Н. Боголюбов
Митрополит Виктор (в миру Леонид Викторович Святин) родился 2 августа (ст. стиля) 1893 г. в станице Карагайской Верхнеуральского уезда Оренбургской губернии. Его отец – Виктор Евграфович Святин, учитель, впоследствии священник Свято-Николаевского собора г. Верхнеуральска. Мать – Мария Петровна – была дочерью атамана Карагайской станицы, войскового старшины Петра Степановича Жукова. Мать Леонида Викторовича умерла рано, оставив пятерых детей (три сына и две дочери), и детей воспитывала бабушка Мария Федоровна Святина (мать отца).
В 1915 г. Леонид Викторович с отличием окончил Оренбургскую Духовную Семинарию и поступил в Казанскую Духовную Академию, но в 1916 г. со второго курса был мобилизован и направлен в Тифлис в Михайловское военное училище. Однако началась революция и он вернулся домой в Верхнеуральск, где был снова мобилизован и направлен в штаб генерала Белова в г. Белорецке, где он и прослужил до отступления250.
Со штабом же генерала Белова он отступал до границы с Китаем. Положение русской армии на границе было ужасным – голодные, раздетые, разутые люди, среди которых началась эпидемия сыпного тифа. Заболел тифом и Леонид Викторович. Как известно, армия на границе была распущена и желающие вернулись домой. Хотел вернуться домой и Леонид Викторович, но случай резко изменил его жизнь. Здесь на границе его, больного тифом, нашел генерал Жуков, Гервасий Петрович, его дядя, родной брат его матери, который с семьей ехал дальше в Китай. Он предложил Леониду Викторовичу поехать вместе с его семьей в Китай. И Леонид Викторович с семьей Жуковых едет в Ханькоу.
Десятки тысяч русских, выброшенных революцией в Китай (по некоторым данным, их было двести тысяч человек251), начинали жизнь в незнакомых условиях Китая – чужая речь, непонятная культура. В это время именно Русская Православная Церковь, имеющая к тому времени двухсотлетние корни в Китае, оказалась тем центром, который объединял всех, оказывая по мере сил и возможностей различную помощь в обустройстве жизни в чужой стране.
Леонид Викторович с детских лет стремился к монашеской жизни и просил у отца благословения вступить на этот путь, еще учась в Духовной Академии, однако отец не дал ему благословения, посоветовав проверить себя и сделать этот шаг в более зрелом возрасте. Узнав о том, что в Пекине существует Российская Духовная Миссия и при ней есть монастырь, он покидает Ханькоу и в начале 1921 г. становится послушником Успенского монастыря в Пекине. То, что он увидел на территории Российской Духовной Миссии, так называемом Бэйгуане (Северном подворье), поразило его. Это была старая Россия с церквами, монастырями, послушниками в скуфейках, монахами в клобуках, но главное – покой, тишина, которые нарушались только колокольным звоном во время церковных служб. Главой Миссии в это время был епископ Иннокентий (Фигуровский), личность незаурядная – именно он восстановил Миссию после того, как она была сожжена дотла во время «боксерского» восстания.
20 июня 1921 г. Леонид Викторович был пострижен в монахи в Пекинском Успенском монастыре с именем Виктор.
24 июня монах Виктор был рукоположен в сан иеродиакона и 27 июня – в сан иеромонаха. Было ему тогда 27 лет и с тех пор никогда и ни при каких условиях он не снимал монашеской рясы. Он всегда был верен монашескому обету нестяжания: никогда не имея имущества, он все раздавал нуждающимся. В последние годы жизни, уже в СССР, он отказался от половины своего жалованья, посчитав его слишком высоким, и все, что получал, рассылал в различные города Союза нуждающимся. Помогал он и жене генерала Жукова, Парасковье Михайловне, которая, вернувшись в 1947 г. из Китая в СССР, последние годы жизни (умерла далеко за 90) жила в Вологде.
Епископ Иннокентий, сразу же поняв душевное устройство молодого монаха, видел в нем своего преемника на посту начальника Миссии – ведь в условиях того времени невозможно было рассчитывать на приезд следующей Миссии из России – и готовил его к этому. Он отправил монаха Виктора во Владивосток на учебу в Восточный Институт – для работы в Миссии было необходимо знание китайского языка.
Однако и на этот раз отец Виктор не смог закончить учение. Политические события на Дальнем Востоке заставили его вернуться в Китай и весной 1922 г. он был назначен настоятелем Покровской церкви в Тяньцзине, городе, расположенном на расстоянии двух часов езды на поезде от Пекина. Здесь он прослужил настоятелем десять лет.
Будучи в самые тяжелые для русской эмиграции годы – начальные годы ее жизни в Китае – настоятелем храма (пока единственного в Тяньцзине, позже будут открыты еще несколько), он смог полностью проявить свои пастырские устремления и недюжинные организаторские способности. Как и в других странах русского рассеяния, церковь была тем центром, который собирал вокруг себя всех русских, и священник становился, как бы мы сейчас сказали, «неформальным лидером». Власти менялись, а церковь – своя, знакомая и близкая, оставалась неизменной. Так случилось и в Китае. Именно при отце Викторе часовня на братской могиле русских воинов преобразовалась в большой Храм Покрова Пресвятой Богородицы252.
При нем открылась русская школа, русская больница, было благоустроено русское кладбище. При нем был открыт Дом милосердия. К нему шли не только православные, но и относящиеся к другим конфессиям, для него не было «ни эллина, ни иудея» и для каждого он находил слова утешения. В Тяньцзине юн пользовался необычайной любовью и уважением не только своих прихожан, но и представителей других вероисповеданий: многоликого Тяныхзиня.
В 1929 г. его возводят в сан архимандрита. В 1931 г. умирает митрополит Иннокентий и начальником Миссии становится архиепископ Симон (Виноградов), который командирует архимандрита Виктора в Югославию, где 21 октября 1932 г. была совершена хиротония его во епископа Шанхайского. В Югославию архимандрит Виктор был откомандирован потому, что Российская Духовная Миссия в Китае в это время подчинялась Святейшему Синоду Российской Православной Церкви за границей. Однако ранней весной 1933 г. умирает и архиепископ Симон и начальником Миссии, 20-м по счету, становится епископ Виктор, пробывший на этом посту 23 года вплоть до закрытия Миссии в 1956 г.
К этому времени – т. е. к 1933 г. – Миссия уже преодолела тот кризис, в который попала в 1917 г.: «С момента русской революции Миссия лишилась притока средств из России и, предоставленная сама себе, пережила тяжелый финансовый кризис,, вызвавший необходимость полной реорганизации ее хозяйства и перевода ее на начала самоокупаемости. Расходы Миссии,,, несмотря на экономию и сокращение деятельности, все же были огромны, ибо на средства Миссии содержались некоторые семьи албазинцев и православных китайцев… Материальное положение Миссии (к 1935 г. – О. К.) упрочилось в связи с улучшением положения русской эмиграции на Дальнем Востоке»253. Поэтому епископ Виктор, будучи начальником Миссии, имел возможность развить широкую миссионерскую деятельность. «За время управления Миссией Архиепископом Виктором открыты: приходы, церкви и молитвенные дома: в Пекине, Калгане, Чифу,. Гирине, на Дамбе, в Гонконге, Кантоне, Макао, построены храм и дом для священника в Маниле, женский монастырь и храм при нем в Какакаши около Дайрена, Св.
Пантелеимоновская санатория с храмом в горах Лаошань, перестроен капитально городской храм и выстроен дом для священника в Циндао, построен большой дом на миссийском участке в Хайларе, построен Св. Покровский храм в Тяньцзине, закончена постройка и освящена Св. Благовещенская церковь на миссийском подворье, в Харбине, не так давно открыт молитвенный дом на Вэйсайде в Шанхае, земля под собором и архиерейским домом и столовой» для неимущих приобретена и записана в лице Начальника и других членов на Миссию, все имущество Православного Братства в Шанхае передано в полную собственность Российской Духовной Миссии в Китае»254.
Однако очень скоро (в 1937 г.) Китай был захвачен японцами. Жизнь русских в условиях оккупации была тяжела. Ситуация осложнилась после нападения фашистской Германии на СССР. Война с Германией вызвала патриотический подъем: среди русских. Многие из них, особенно те, кто участвовал в Первой мировой войне, испытывали комплекс вины от невозможности помочь Родине в трудный для нее час.
В 1937 г. епископа Виктора возводят в сан архиепископа.
Тоска по оставленной Родине, мысль о возвращении в Россию не оставляли его никогда. Я помню мешочек с русской землей, хранившийся у него в сейфе в его покоях в Бэйгуане – кроме этого, в сейфе ничего не было. Он был уверен, что русские люди рано или поздно вернутся на Родину. Еще в 1935 г. он писал: «Они (русские – О. К.) были вынуждены отойти за границу, унося с собой из Родины только тяжелую скорбь о потерянном и честное русское имя да великое сокровище – Святую Православную Веру…»255. И далее: «Когда изгнанники, дети и внуки их вернутся в свое воскресшее Отечество и снова начнут строить величие его, вспомнят они о дружбе Великого Китая и сумеют ответить на нее верной русской дружбой»256.
В конце 1944 г. еще во время японской оккупации архиепископ Виктор отправил в советское посольство в Пекине своего родственника, мужа своей сестры Бориса Михайловича Кепинга, который отнес туда официальный рапорт на имя Патриарха Московского и всея Руси с просьбой о воссоединении с Патриаршей Церковью.
Ответа не было. И тогда, заручившись согласием Иоанна, епископа Шанхайского, архиепископ Виктор снова посылает в Москву прошение от себя и от епископа Иоанна с просьбой принять их в церковное общение. Ответ пришел только в апреле 1946 г.: «Вторично (? – О. К.) с любовью сообщаем Вам о принятии Вас и преосвященного Иоанна Шанхайского в молитвенное каноническое общение с нами. Российская Духовная Миссия в Китае, возглавляемая Вашим преосвященством, как ранее будет состоять в непосредственном ведении Патриарха Московского. Прошу прислать сведения и отчет за последний год. Шлю благословение Господне и сердечный привет Вам и епископу Иоанну. Патриарх Алексий. Москва, 6/19 апреля 1946 года»257.
Политическое положение в Китае было очень неустойчивым: шла гражданская война. Русская эмиграция разделилась на две части – одни возвращались на Родину (в течение 1947 г. было осуществлено несколько репатриаций из различных городов Китая), другие уезжали в Австралию, Америку и страны Латинской Америки.
В Русской Православной Церкви также произошел раскол: «В мае 1946 г. епископ Иоанн, находящийся под сильным влиянием митрополита Анастасия, отошел от избранного им верного пути, впал в раскол. Началась смута… Китайские гоминьдановские власти поддержали епископа Иоанна»258.
19 октября 1946 г. на рассвете в своих покоях в Шанхае был арестован архиепископ Виктор. «Китайский Благовестник» писал: «Весть об этом событии (т. е. об аресте – О. К.) всколыхнула весь многонациональный Шанхай, не говоря уже о русской колонии, остро переживавшей заточение своего духовного Главы… В газетах стали публиковаться письма с выражением симпатии православным христианам и самому Архипастырю»259.
Через пять дней только после вмешательства представителей советского консульства Владыка Виктор был освобожден. Однако несмотря на краткий срок заключения, в результате потрясения он перенес микроинсульт – на некоторое время у него была нарушена речь.
Причина ареста – имущество Миссии, на страже которого стоял Владыка Виктор.
Митрополит Иннокентий не ошибся в выборе своего преемника – только такой человек, человек долга, бессребреник, мог выстоять в тех тяжелейших условиях. Его долг был сохранить имущество Миссии для России – и он сохранил это имущество.
Но он ясно осознавал необходимость новой, присланной из России Миссии – русская молодежь уезжала из Китая, священнослужители были стариками и он с ужасом думал о том, что же ждет Миссию впереди. Во второй половине сороковых годов он шлет целый ряд рапортов Патриарху Алексию, в которых настойчиво просит прислать новую, 21-ю миссию. Обратимся к его рапорту под № 266, датированному «канун праздника Введения во храм пресвятой Богородицы 1949 года». Из этого рапорта совершенно ясно, что это отнюдь не первая просьба о присылке Миссии в Китай: «Этот мой рапорт является отчасти повторением содержания прошлых рапортов, отчасти будет наполнен новым содержанием согласно требованиям текущего момента. Первая и основная просьба Миссии к Вашему Святейшеству это ходатайство перед Министерством иностранных дел Советского Союза о выяснении правового положения нашей Миссии в Китае при новом государственном строе и о формальном закреплении за Миссией недвижимого имущества, на которое имеются документы».
Цитируемый рапорт состоит из двух частей: в первой перечисляется все недвижимое имущество Миссии, имеющееся в различных городах Китая и за его пределами, во второй излагается конкретная программа деятельности будущей 21-й миссии.
Я не буду подробно останавливаться на имуществе Миссии (перечисление его в рапорте занимает несколько страниц), назову только то, чем владела Миссия в городе Пекине и его окрестностях. Помимо 17 гектаров Бэйгуаня, т. е. той территории, на которой располагалась сама Миссия, она владела трехэтажным домом на улице Хадамэнь № 185; миссийским православным кладбищем за Аньдинмэнь; в горах Сишань около Пекина Миссия имела скит; в 200 верстах от Пекина в деревне Дундиннань Миссия владела участком земли, на котором находились храм и жилые помещения, разрушенные в последнюю гражданскую войну; в местечке Бадаханьгоу на расстоянии 200 верст от Пекина Миссия владела обширнейшим участком богатой лесом и недрами земли. И это только Пекин и его окрестности. Имущество Миссии имелось также и в других городах Китая: Тяньцзине, Калгане, Циндао, Ханькоу, Шанхае, Бэйдайхэ.
Миссия владела также имуществом вне Китая – в Маниле, Корее, Гонконге. В Москве и Петербурге Миссия имела хорошо оборудованные подворья с домами, а севернее Петербурга в сторону Финляндии – дачу «Отрадное».
В этом же рапорте архиепископ Виктор пишет: «За последние десятилетия государственные власти в Китае менялись, как в калейдоскопе. У всех тянулись руки к захвату имущества, не имеющего государственной защиты. Приходится удивляться, как это удалось не только сохранить, что имелось, но даже и приумножить миссийское имущество. И вот теперь, когда «настало время благоприятное и день спасения», когда к власти дома на Родине и здесь в Китае пришла народная демократия, все это ценнейшее имущество, как «заколдованный клад», находится в беспризорности и бездействии «под семью замками и печатями». Я не министр финансовых предприятий, каким был восстановитель Миссии после Боксерского восстания Великий Святитель Митрополит Иннокентий, и не святой Божий человек – аскет и молитвенник, каким был Владыка Архиепископ Симон, которому благодатно давалось без всяких усилий всякое знание, я простой смертный и грешный человек.
Мне пришлось наблюдать и переживать начавшийся еще при Митрополите Иннокентии распад Миссии, душа болела за разрушенные и оскверненные храмы в Калгане, Тяньцзине, в деревне Дундинъань, в Чапее, в Шанхае и на Маниле, пришлось видеть крайнюю нищету русских людей и насельников Миссии – китайцев, которые стали мне дороги, может быть, потому, что с ними и от них мне пришлось многое перетерпеть и от них же иметь внимание, заботу и защиту. Я люблю Миссию, знаю ее ценность для Св. Православной Русской Церкви и Родины и горячо верю в ее светлое будущее. Слушая сообщения радио Советского Союза и знакомясь по газетам и книгам с постановкой хозяйства в Советской России, я крепко осознал, что советский человек сдвинет всю жизнь нашей дорогой Российской Духовной Миссии в Китае с мертвой точки, выведет ее из состояния мучительной прострации на спасительные пути возрождения и расцвета и даст ей то положение, которое она должна занимать среди других инославных миссий по достоинству Св. Православной Русской Церкви и нашего Великого Русского Народа.
Все будет зависеть от движущей живой силы – кадров Миссии. Этот вопрос самый деловой, серьезнейший вопрос. Здесь среди местного русского населения почти нет подходящих людей для большой организационной работы. Уставшие и больные душевно, эти люди не дадут должного горения и одушевления делу, а приехавшие с Родины будут более авторитетны и для местного китайского населения. Вот почему я раньше писал и просил и теперь снова почтительно подтверждаю, что в Китай нужно послать из Советского Союза новую 21-ю Российскую Духовную Миссию»260.
Во второй части этого же рапорта излагаются основные направления работы 21-й миссии: «В продолжение трех–пяти лет Миссия в экономическом отношении должна встать на собственные ноги и вернуть Патриархии все, что было и будет затрачено. Потенциальные возможности у Миссии огромны, но в данный момент, в силу чисто исторических обстоятельств и событий, экономическое положение Миссии плачевно. Земельные участки и другое недвижимое имущество Миссии не используется должным образом, предприятия не оправдывают себя, здания за ненедостатком капитального ремонта разрушаются, небольшое число людей, обслуживающих Миссию, бедствует.
Не хватает материальных средств, не хватает рабочих рук, нет должного хозяйственного руководства. Необходимы героические усилия со стороны самой Миссии, необходима существенная помощь от Московской Патриархии, необходима забота и помощь Родины».
В конце же этого рапорта просто мольба, крик о помощи: «Ваше Святейшество, помогите Миссии выйти из тупика, в котором она находится не по своей вине, введите в ее организм новые животворные силы, протяните ей в наступающий двенадцатый час спасительную отеческую руку».
Но Москва 21-ю миссию в Пекин не прислала.
Архиепископ Виктор получил приказ Патриархии упразднить Миссию и в 1956 г. вернулся на Родину, где получил назначение в Краснодарскую епархию. Здесь он прожил ровно десять лет. В 1961 г. был возведен в сан митрополита. В августе 1966 г. его не стало. Официальное заключение о смерти – инфаркт легких.
Султанат Ачех — 1 Кепинг 1260 (1844) KM# 1 | История в Монетах by Green Cat
Ачех — мусульманский султанат на севере острова Суматра.
По всей видимости, был основан бежавшим монархом королевства Чампа в 15 веке, после того, как тогдашняя столица тямов — Виджайя — была захвачена и разграблена вьетнамцами (про взаимоотношения тямов и вьетов я упоминал в истории Вьетнама).
Ещё до основания Ачеха север Суматры был центром распространения ислама в регионе. Поэтому новый и амбициозный султанат сразу же заручился поддержкой Османской Империи, став юридически её протекторатом (османский правитель Сулейман Великолепный уже тогда воевал по глобусу, ещё до того как это стало мейнстримом).
Получив огнестрельное оружие от османов и даже небольшой отряд оттуда же, Ачех быстро начал расширять свои владения. На пике своего могущества в 17 веке Султанат подчинил себе всю Суматру и Малайю (в том числе султанат Паханг). Впрочем, сразу же после рассвета начался и закат — череда смен правителей подарила политическую нестабильность и децентрализацию региона.
В 1873 г. Нидерланды, заключив с Великобританией Суматранский трактат, напали на Ачех. Султанат просил о помощи великую Порту, так как оставался её протекторатом, но к тому времени у турок хватало своих проблем. Понимая тяжесть своего положения, султанат обращался даже к России с просьбой принять его в русское подданство (представляете, могла быть Индоруссия ), но для мировых держав этот регион уже давно был частным делом голландцев и британцев.
#coin #coins #coincollector #numismatics #coincollection #money #instacoins #collection #history #история #нумизматика #монеты #монетымира #историявмонетах #голландскаяостиндия #индонезия #ачех #аче #atjeh #aceh #dutcheastindies #indonesia
| Библиографическое описание | Приложение к письму генерального консула СССР в Пекине С.Л. Тихвинского. Письмо арх. Виктора генконсулу с просьбой о разрешении репатриации в Советский Союз его сестры О.В. Кепинг с мужем и детьми. 25-го декабря 1948 года // АВП РФ. Ф. 0100. Оп. 42. П. 290. Д. 43. Л. 28-30, 30 об. Машинописный экз. Подлинник. Приложение — рук. экз. Публикуется впервые. |
| Тип материала | исторический документ (215151) |
| Автор документа | Виктор (Архиепископ) (2) |
| Название документа | Приложение к письму генерального консула СССР в Пекине С.Л. Тихвинского. Письмо арх. Виктора генконсулу с просьбой о разрешении репатриации в Советский Союз его сестры О.В. Кепинг с мужем и детьми. 25-го декабря 1948 года (1) |
| Дата документа | 1948 (909) |
| Шифр | АВП РФ. Ф. 0100. Оп. 42. П. 290. Д. 43. Л. 28-30, 30 об. Машинописный экз. Подлинник. Приложение — рук. экз. Публикуется впервые.
(2) |
| Архив | Архив внешней политики РФ (АВП РФ) (6398) |
| Имена | Виктор
(23) Кепинг, О.В. (1) |
| География | Китай
(3021) СССР (2526) |
| Даты | 1948 (937) |
| Статус | Архиепископ
(228) Генконсул (21) |
| Тематика | Международные отношения — Китай
(3408) Международные отношения в период после Второй мировой войны (1801) |
| Виды документов | Письмо
(15453) Приложение (2537) |
| Источник документа | Русско-китайские отношения в XX веке: Материалы и документы. Т. V. Советско-китайские отношения. 1946-февраль 1950. Кн. 2. 1949-февраль 1950 гг. — М.: Памятники исторической мысли, 2005. (248) |
| Составитель записи | 2020-02-03 / Сергеева Наталия (2310) |
Л. Тихвинского. Письмо арх. Виктора генконсулу с просьбой о разрешении репатриации в Советский Союз его сестры О.В. Кепинг с мужем и детьми. 25-го декабря 1948 годаТрадиционные и нетрадиционные механизмы кэпирования вирусной мРНК
Шаткин А.
Кэппинг эукариотических мРНК. Ячейка 9 , 645 (1976).
CAS Статья PubMed Google ученый
Darnell, J. E. Jr. Единицы транскрипции для продукции мРНК в эукариотических клетках и их ДНК-вирусах. Прог. Nucleic Acid Res. Мол. Биол. 22 , 327–353 (1979).
CAS Статья PubMed Google ученый
Филипович, В.и другие. Белок, связывающий метилированную 5′-концевую последовательность m 7 GpppN эукариотической информационной РНК. Proc. Natl Acad. Sci. США 73 , 1559–1563 (1976).
CAS Статья PubMed Google ученый
Шиблер У. и Перри Р. П. 5′-концы гетерогенной ядерной РНК: сравнение молекул разного размера и возраста. Nucleic Acids Res. 4 , 4133–4149 (1977).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Артикул PubMed Google ученый
Наллагатла С. Р., Торони Р. и Бевилаква П. С. Блестящая маскировка собственной РНК: 5′-концевые и внутренние модификации первичных транскриптов подавляют элементы врожденного иммунитета. RNA Biol. 5 , 140–144 (2008).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Rehwinkel, J. et al. RIG-I обнаруживает вирусную геномную РНК во время инфицирования вирусом РНК с отрицательной цепью.
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Фуруичи, Ю.& Шаткин, А. Дж. Кеппинг вирусной и клеточной мРНК: прошлое и перспективы. Adv. Вир. Res. 55 , 135–184 (2000). Историческая и хронологическая перспектива открытия кэппинга РНК и структуры кэпинга РНК.
CAS Статья Google ученый
Furuichi, Y., Muthukrishnan, S. & Shatkin, AJ 5′-Terminal m- 7 G (5 ‘) ppp (5’) G m p in vivo : идентификация в реовирусе геномная РНК. Proc. Natl Acad. Sci. США 72 , 742–745 (1975).
CAS Статья PubMed Google ученый
Шаткин А. Дж. Синтез метилированной информационной РНК in vitro очищенным реовирусом. Proc. Natl Acad. Sci. США 71 , 3204–3207 (1974).
CAS Статья PubMed Google ученый
Вэй, К.М. и Мосс, Б. Метилированные нуклеотиды блокируют 5′-конец матричной РНК вируса осповакцины. Proc. Natl Acad. Sci. США 72 , 318–322 (1975).
CAS Статья Google ученый
Шаткин, А. Дж. И Оба, Г. В. мРНК реовируса: транскрипционная трансляция. Cell 7 , 305–313 (1976).
CAS Статья PubMed Google ученый
Фуруичи, Ю., Morgan, M., Muthukrishnan, S. & Shatkin, A. J. Информационная РНК реовируса содержит метилированную, заблокированную 5′-концевую структуру: m 7 G (5 ‘) ppp (5’) G m pCp-. Proc. Natl Acad. Sci. США 72 , 362–366 (1975).
CAS Статья PubMed Google ученый
Muthukrishnan, S., Both, G. W., Furuichi, Y. & Shatkin, A. J. 5′-Концевой 7-метилгуанозин в мРНК эукариот необходим для трансляции. Nature 255 , 33–37 (1975).
CAS Статья PubMed Google ученый
Marcotrigiano, J., Gingras, A.C., Sonenberg, N. & Burley, S.K. Кокристаллическая структура 5′-кэп-связывающего белка матричной РНК (eIF4E), связанного с 7-метил-GDP. Cell 89 , 951–961 (1987).
Артикул Google ученый
Перри, К.Л., Уоткинс, К. П. и Агабиан, Н. Трипаносомные мРНК имеют необычные структуры «cap 4», полученные путем добавления сплайсированного лидера. Proc. Natl Acad. Sci. США 84 , 8190–8194 (1987).
CAS Статья PubMed Google ученый
Билман, К. А. и Паркер, Р. Деградация мРНК у эукариот. Cell 81 , 179–183 (1995).
CAS Статья PubMed Google ученый
Houseley, J.И Толлервей Д. Многочисленные пути деградации РНК. Cell 136 , 763–776 (2009).
CAS Статья Google ученый
Оцука Ю., Кедерша Н. Л. и Шенберг Д. Р. Идентификация цитоплазматического комплекса, который добавляет кэп к 5′-монофосфатной РНК. Мол. Клетка. Биол. 29 , 2155–2167 (2009).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Шенберг, Д.Р. и Макват, Л. Э. Перепечатка сообщения. Trends Biochem. Sci. 34 , 435–442 (2009).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Goodfellow, I. et al. Инициация трансляции калицивируса требует взаимодействия между VPg и eIF4E. EMBO Rep. 6 , 968–972 (2005).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Амброс, В., Петтерссон, Р. Ф. и Балтимор, Д. Ферментативная активность в неинфицированных клетках, которая расщепляет связь между РНК полиовириона и 5′-концевым белком. Cell 15 , 1439–1446 (1978).
CAS Статья PubMed Google ученый
Амброс В. и Балтимор Д. Очистка и свойства клеточного фермента HeLa, способного удалять 5′-концевой белок из РНК полиовируса. J. Biol.Chem. 255 , 6739–6744 (1980).
CAS PubMed Google ученый
Cong, P. & Shuman, S. Мутационный анализ мРНК-кэпирующего фермента идентифицирует аминокислоты, участвующие в связывании GTP, образовании фермента-гуанилата и переносе GMP на РНК. Мол. Клетка. Биол. 15 , 6222–6231 (1995).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Де ла Пенья, М., Кириелейс, О. Дж. П. и Кьюсак, С. Структурные представления о механизме и эволюции мРНК кэп N7 метилтрансферазы вируса осповакцины. EMBO J. 26 , 4913–4925 (2007). Работа, показывающая активацию МТазного домена D1 в комплексе с субъединицей D12 при атомном разрешении.
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Mao, X. & Shuman, S. Внутренняя РНК (гуанин-7) метилтрансферазная активность субъединицы D1 кэпирующего фермента вируса осповакцины стимулируется субъединицей D12.Идентификация аминокислотных остатков в белке D1, необходимых для ассоциации субъединиц и переноса метильных групп. J. Biol. Chem. 269 , 24472–24479 (1994). Открытие и молекулярная основа активации вирусной МТазы белковым кофактором.
CAS PubMed Google ученый
Schnierle, BS, Gershon, PD & Moss, B. Cap-специфическая мРНК (нуклеозид- O 2 ‘ -) — стимулирующая активность вируса осповакцины метилтрансферазой и поли (A) полимеразой опосредована одиночный белок. Proc. Natl Acad. Sci. США 89 , 2897–2901 (1992).
CAS Статья PubMed Google ученый
Benarroch, D. et al. Активность РНК-геликазы, нуклеотид-5′-трифосфатазы и РНК-5′-трифосфатазы белка NS3 вируса Денге зависит от Mg 2+ и требует наличия функционального мотива Walker B в каталитическом ядре геликазы. Вирусология 328 , 208–218 (2004).
CAS Статья PubMed Google ученый
Myette, J. R. & Niles, E. G. Характеристика активностей 5′-трифосфатазы и нуклеотидтрифосфатфосфогидролазы РНК вируса осповакцины показывает, что обе активности осуществляются в одном и том же активном центре. J. Biol. Chem. 271 , 11945–11952 (1996).
CAS Статья PubMed Google ученый
Васкес-Дель Карпио, Р., Gonzalez-Nilo, F. D., Riadi, G., Taraporewala, Z. F. & Patton, J. T. Гистидиновый триадоподобный мотив октамера ротавируса NSP2 опосредует активности как RTPase, так и NTPase. J. Mol. Биол. 362 , 539–554 (2006).
CAS Статья PubMed Google ученый
Jayaram, H., Taraporewala, Z., Patton, J. T. & Prasad, B. V. V. Ротавирусный белок, участвующий в репликации и упаковке генома, демонстрирует HIT-подобную складку. Природа 417 , 311–315 (2002). Первая кристаллическая структура RTPase с HIT-подобной складкой.
CAS Статья PubMed Google ученый
Тарапоревала, З., Чен, Д. и Паттон, Дж. Т. Мультимеры, образованные неструктурным белком ротавируса NSP2, связываются с РНК и обладают нуклеозидтрифосфатазной активностью. J. Virol. 73 , 9934–9943 (1999).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Тарапоревала, З.Ф. и Паттон, Дж. Т. Идентификация и характеристика дестабилизирующей спираль активности ротавирусного неструктурного белка NSP2. J. Virol. 75 , 4519–4527 (2001).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Benarroch, D., Smith, P. & Shuman, S. Характеристика трифункционального фермента, улавливающего мРНК мимивируса, и кристаллической структуры домена РНК-трифосфатазы. Структура 16 , 501–512 (2008).
CAS Статья Google ученый
Гу, М. и Лима, К. Д. Обработка сообщения: структурное понимание кэппинга и декапирования мРНК. Curr. Opin. Struc. Биол. 15 , 99–106 (2005).
CAS Статья Google ученый
Лима, К. Д., Ван, Л. К. и Шуман, С.Структура и механизм дрожжевой РНК-трифосфатазы: важный компонент кэпирующего аппарата мРНК. Cell 99 , 533–543 (1999). Первая кристаллическая структура РТФазы, участвующей в кэппировании РНК.
CAS Статья Google ученый
Шуман, С. Структура, механизм и эволюция аппарата кэппинга мРНК. Прог. Nucleic Acid Res. Мол. Биол. 66 , 1–40 (2001).
CAS PubMed Google ученый
Lehman, K., Schwer, B., Ho, CK, Rouzankina, I. & Shuman, S. Консервативный домен дрожжевой РНК-трифосфатазы, фланкирующий каталитическое ядро, регулирует самоассоциацию и взаимодействие с гуанилилтрансферазным компонентом аппарат кэппинга мРНК. J. Biol. Chem. 274 , 22668–22678 (1999).
CAS Статья PubMed Google ученый
Горбаленя, А.Э. и Кунин Э. В. Еще один консервативный мотив последовательности в геликазах. Nucleic Acids Res. 16 , 7734 (1988).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Горбаленя А.Э. и Кунин Е.В. Вирусные белки, содержащие паттерн пуриновой последовательности, связывающей NTP. Nucleic Acids Res. 17 , 8413–8440 (1989).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Горбаленя, А.Э., Кунин Э. В., Донченко А. П. и Блинов В. М. Два родственных суперсемейства предполагаемых геликаз, участвующих в репликации, рекомбинации, репарации и экспрессии геномов ДНК и РНК. Nucleic Acids Res. 17 , 4713–4730 (1989).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Луо, Д. и др. Понимание раскручивания РНК и гидролиза АТФ белком NS3 флавивируса. EMBO J. 27 , 3209–3219 (2008).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Гу, М. и Райс, К. М. Три конформационных снимка геликазы NS3 вируса гепатита С раскрывают механизм транслокации с храповым механизмом. Proc. Natl Acad. Sci. США 107 , 521–528 (2010).
CAS Статья PubMed Google ученый
Лескар, Дж.и другие. На пути к созданию противовирусных ингибиторов против флавивирусов: случай использования многофункционального белка NS3 вируса Денге в качестве мишени. Antiviral Res. 80 , 94–101 (2008).
CAS Статья PubMed Google ученый
Луо, Д. и др. Гибкость между доменами протеазы и геликазы белка NS3 вируса денге, обеспечиваемая линкерной областью, и ее функциональные последствия. J Biol. Chem. 285 , 18817–18827 (2010).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Луо, Д. и др. Кристаллическая структура протеазы-геликазы NS3 вируса денге. J. Virol. 82 , 173–183 (2008).
CAS Статья PubMed Google ученый
Sampath, A. et al.Структурный мутационный анализ геликазы NS3 вируса денге. J. Virol. 80 , 6686–6690 (2006).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Balistreri, G., Caldentey, J., Kääriäinen, L. & Ahola, T. Ферментативные дефекты белков nsP2 чувствительных к температуре мутантов вируса леса Семлики. J Virol. 81 , 2849–2860 (2007).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Чангела, А., Хо, К. К., Мартинс, А., Шуман, С. и Мондрагон, А. Структура и механизм РНК-трифосфатазного компонента фермента, улавливающего мРНК млекопитающих. EMBO J. 20 , 2575–2586 (2001).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Takagi, T., Moore, C.R., Diehn, F. & Buratowski, S. РНК 5′-трифосфатаза, родственная протеинтирозинфосфатазам. Cell 89 , 867–873 (1997).
CAS Статья PubMed Google ученый
Шуман, С. и Лима, К. Д. Суперсемейство полинуклеотидлигазы и РНК-кэпирующего фермента ковалентных нуклеотидилтрансфераз. Curr. Opin. Struct. Биол. 14 , 757–764 (2004).
CAS Статья PubMed Google ученый
Ван, С. П., Дэн, Л., Хо, К. К., Шуман, С.Филогения кэпирующих ферментов мРНК. Proc. Natl Acad. Sci. США 94 , 9573–9578 (1997).
CAS Статья PubMed Google ученый
Конг П. и Шуман С. Ковалентный катализ при переносе нуклеотидила. Мотив KTDG, необходимый для образования комплекса фермент-GMP под действием фермента, улавливающего мРНК, сохраняется в активных сайтах РНК и ДНК-лигаз. J. Biol. Chem. 268 , 7256–7260 (1993).
CAS PubMed Google ученый
Найлс, Э. Г. и Кристен, Л. Идентификация лизина активного центра мРНК гуанилтрансферазы вируса осповакцины. J. Biol. Chem. 268 , 24986–24989 (1993).
CAS PubMed Google ученый
Шуман, С. и Гурвиц, Дж. Механизм кэпирования мРНК гуанилилтрансферазой вируса осповакцины: характеристика промежуточного фермента-гуанилата. Proc. Natl Acad. Sci. США 78 , 187–191 (1981).
CAS Статья PubMed Google ученый
Швер Б. и Шуман С. Мутационный анализ фермента, укрывающего мРНК дрожжей. Proc. Natl Acad. Sci. США 91 , 4328–4332 (1994).
CAS Статья PubMed Google ученый
Линдаль, Т. и Барнс, Д.E. ДНК-лигазы млекопитающих. Annu. Rev. Biochem. 61 , 251–281 (1992).
CAS Статья PubMed Google ученый
Chu, C. et al. Структура гуанилилтрансферазного домена кэпирующего фермента мРНК человека. Proc. Natl Acad. Sci. США 108 , 10104–10108 (2011).
CAS Статья PubMed Google ученый
Фабрега, К., Шен, В., Шуман, С. и Лима, С. D. Структура фермента, улавливающего мРНК, связанного с фосфорилированным карбокси-концевым доменом РНК-полимеразы II. Мол. Ячейка 11 , 1549–1561 (2003).
CAS Статья PubMed Google ученый
Håkansson, K., Doherty, A.J., Shuman, S. & Wigley, D. B. Рентгеновская кристаллография выявляет большие конформационные изменения во время переноса гуанила с помощью ферментов, укрывающих мРНК. Cell 89 , 545–553 (1997). Исследование, которое расшифровывает реакцию GTase, с соответствующими снимками кристаллической структуры.
Артикул PubMed Google ученый
Håkansson, K. & Wigley, D. B. Структура комплекса между аналогом кэпа и мРНК гуанилилтрансферазой демонстрирует структурную химию кэппинга РНК. Proc. Natl Acad. Sci. США 95 , 1505–1510 (1998).
Артикул PubMed Google ученый
Рейниш К. М., Ниберт М. Л. и Харрисон С. С. Структура ядра реовируса при разрешении 3,6 A. Nature 404 , 960–967 (2000). Отчет с подробным описанием всей линии сборки колпачков ортореовирусной РНК с атомным разрешением.
CAS Статья PubMed Google ученый
Саттон, Г., Grimes, J.M., Stuart, D.I. & Roy, P.VP4 вируса синего языка представляет собой конвейерную линию для улавливания РНК. Nature Struct. Мол. Биол. 14 , 449–451 (2007).
CAS Статья Google ученый
Cheng, L. et al. Атомная модель циповируса, построенная на основе крио-ЭМ-структуры, дает представление о механизме кэппирования мРНК. Proc. Natl Acad. Sci. США 108 , 1373–1378 (2011).
CAS Статья PubMed Google ученый
Ким, Дж., Тао, Ю., Рейниш, К. М., Харрисон, С. С. и Ниберт, М. Л. Коровые белки ортореовируса и акваровируса: консервативные ферментативные поверхности, но не межбелковые интерфейсы. Virus Res. 101 , 15–28 (2004).
CAS Статья PubMed Google ученый
Луонго, К. Л., Райниш, К. М., Харрисон, С. С. и Ниберт, М. Л. Идентификация области гуанилилтрансферазы и активного сайта в белке, кэпирующем мРНК реовируса λ2. J. Biol. Chem. 275 , 2804–2810 (2000).
CAS Статья PubMed Google ученый
Issur, M. et al. Белок NS5 флавивируса представляет собой истинную РНК-гуанилилтрансферазу, которая катализирует двухстадийную реакцию с образованием кэп-структуры РНК. РНК 15 , 2340–2350 (2009).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Бизайон, М.И Лемей, Г. Вирусные и клеточные ферменты, участвующие в синтезе структуры крышки мРНК. Virology 236 , 1–7 (1997).
CAS Статья PubMed Google ученый
Egloff, MP, Benarroch, D., Selisko, B., Romette, JL & Canard, B. РНК-кэп (нуклеозид-2′-O-) — метилтрансфераза в флавивирусной РНК-полимеразе NS5: кристаллическая структура и функциональная характеристика. EMBO J. 21 , 2757–2768 (2002). Характеристика первой (+) РНК-вирусной МТазы при атомном разрешении.
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Мартин, Дж. Л. и Макмиллан, Ф. М. SAM (зависимый) I AM: S -аденозилметионин-зависимая метилтрансфераза. Curr. Opin. Struct. Биол. 12 , 783–793 (2002).
CAS Статья PubMed Google ученый
Шуберт, Х.Многие пути к метилтрансферу: хроника конвергенции. Trends Biochem. Sci. 28 , 329–335 (2003).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Decroly, E. et al. Кристаллическая структура и функциональный анализ комплекса SARS-РНК коронавируса кэп 2′-O-метилтрансферазы nsp10 / nsp16. PLoS Pathog. 7 , e1002059 (2011).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Эглофф, М.P. et al. Структурный и функциональный анализ требований к метилированию и последовательности 5′-РНК короткокапированных РНК метилтрансферазным доменом NS5 вируса денге. J. Mol. Биол. 372 , 723–736 (2007).
CAS Статья PubMed Google ученый
Донг, Х., Рен, С., Ли, Х. и Ши, П. Ю. Отдельные молекулы метилтрансферазы вируса Западного Нила могут независимо катализировать метилирование N7 и 2′- O вирусной РНК cap. Вирусология 377 , 1–6 (2008).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Ray, D. et al. 5′-кэп-структура вируса Западного Нила образована последовательным метилированием гуанина N-7 и рибозы 2′-O неструктурным белком 5. J. Virol. 80 , 8362–8370 (2006).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Фабрега, К., Хаусманн, С., Шен, В., Шуман, С. и Лима, С. Д. Структура и механизм мРНК кэп (гуанин-N7) метилтрансферазы. Мол. Cell 13 , 77–89 (2004).
CAS Статья PubMed Google ученый
Bujnicki, J. M. & Rychlewski, L. Переназначение специфичности двух кэп-доменов метилтрансферазы в белке λ2 реовируса. Genome Biol. 2 , RESEARCH0038.1 – RESEARCH0038.6 (2001).
Артикул Google ученый
Феррон, Ф., Лонги, С., Хенриссат, Б. и Канард, Б. Вирусные РНК-полимеразы — предполагаемый домен 2′-O-рибозометилтрансферазы, общий для всех Mononegavirales . Trends Biochem. Sci. 27 , 222–224 (2002).
CAS Статья PubMed Google ученый
Ходел, А. Э., Gershon, P. D., Shi, X. & Quiocho, F. A. Структура 1,85 Å белка вакцины VP39: бифункциональный фермент, который участвует в модификации обоих концов мРНК. Cell 85 , 247–256 (1996). Первая кристаллическая структура вирусного фермента, участвующего в кэппировании РНК.
CAS Статья PubMed Google ученый
Lockless, S. W., Cheng, H. T., Hodel, A. E., Quiocho, F. A. & Gershon, P.D. Распознавание кэпированных РНК-субстратов с помощью VP39, мРНК, кодируемой вирусом осповакцины, кэп-специфической 2′- O -метилтрансферазы. Биохимия 37 , 8564–8574 (1998).
CAS Статья PubMed Google ученый
Li, C., Xia, Y., Gao, X. & Gershon, P. D. Механизм 2′-O-метилирования РНК: данные о том, что каталитический лизин действует скорее для управления, чем для депротонирования целевого нуклеофила. Биохимия 43 , 5680–5687 (2004).
CAS Статья PubMed Google ученый
Hodel, A. E., Gershon, P. D. & Quiocho, F. A. Структурная основа неспецифического по последовательности узнавания 5′-кэпированной мРНК ферментом, модифицирующим кэп. Мол. Cell 1 , 443–447 (1998). Статья, в которой обсуждаются молекулярные основы селективности N7-метилированного кэпа и детализируется кристаллическая структура первого белка кэпа РНК.
CAS Статья PubMed Google ученый
Буве, М. и др. In vitro восстановление метилирования кэпа мРНК коронавируса SARS. PLoS Pathog. 6 , e1000863 (2010).
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Chen, Y. et al. Функциональный скрининг выявляет неструктурный белок коронавируса SARS nsp14 как новую кэп-метилтрансферазу N7. Proc. Natl Acad. Sci USA 106 , 3484–3489 (2009).
CAS Статья PubMed Google ученый
Decroly, E. et al. Неструктурный белок 16 коронавируса представляет собой связывающий кэп-0 фермент, обладающий (нуклеозид-2 ‘ O ) -метилтрансферазной активностью. J. Virol. 82 , 8071–8084 (2008).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Рамадеви, Н., Берроуз, Н. Дж., Мертенс, П. П., Джонс, И. М. и Рой, П. Кэппирование и метилирование мРНК очищенным рекомбинантным белком VP4 вируса блютанга. Proc. Natl Acad. Sci. США 95 , 13537–13542 (1998).
CAS Статья PubMed Google ученый
Рамадеви, Н. и Рой, П. Ядерный белок вируса синего языка VP4 обладает нуклеозидтрифосфатфосфогидролазной активностью. J. Gen. Virol. 79 , 2475–2480 (1998).
CAS Статья PubMed Google ученый
Abraham, G., Rhodes, D. P. & Banerjee, A.K. 5′-концевая структура метилированной мРНК синтезируется in vitro вирусом везикулярного стоматита . Cell 5 , 51–58 (1975).
CAS Статья PubMed Google ученый
Abraham, G., Rhodes, D. P.И Банерджи, А. К. Новое инициирование синтеза РНК in vitro вирусом везикулярного стоматита. Nature 255 , 37–40 (1975).
CAS Статья PubMed Google ученый
Гупта, К. и Рой, П. Альтернативные механизмы кэппинга для транскрипции весенней виремии карповируса: доказательства независимой инициации мРНК. J. Virol. 33 , 292–303 (1980).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Barik, S. Структура 5′-концевой крышки мРНК респираторно-синцитиального вируса. J. Gen. Virol. 74 , 485–490 (1993).
CAS Статья PubMed Google ученый
Огино Т. и Банерджи А. К. Мотив HR в белке РНК-зависимой РНК-полимеразы L вируса Чандипура необходим для нетрадиционной активности кэппинга мРНК. J. Gen. Virol. 91 , 1311–1314 (2010).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Огино Т. и Банерджи А. К. Нетрадиционный механизм кэппирования мРНК РНК-зависимой РНК-полимеразой вируса везикулярного стоматита. Мол. Cell 25 , 85–97 (2007). Выяснение нетрадиционного пути кэппирования РНК (-) РНК-вирусов.
CAS Статья PubMed Google ученый
Bujnicki, J.M. & Rychlewski, L. Идентификация In silico , предсказание структуры и филогенетический анализ домена 2′- O -рибоза (cap 1) метилтрансферазы в большом структурном белке вирусов с отрицательной цепью ssRNA. Protein Eng. 15 , 101–108 (2002).
CAS Статья PubMed Google ученый
Li, J., Fontaine-Rodriguez, E.C. & Whelan, S.P. Аминокислотные остатки в консервативном домене VI белка большой полимеразы вируса везикулярного стоматита, необходимого для активности мРНК cap-метилтрансферазы. J. Virol. 79 , 13373–13384 (2005).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Rahmeh, A. A., Li, J., Kranzusch, P. J. & Whelan, S. P. J. Метилирование 2′-O рибозы кэпа мРНК вируса везикулярного стоматита предшествует последующему метилированию гуанин-N-7 большим полимеразным белком и облегчает его. J. Virol. 83 , 11043–11050 (2009). Статья, имеющая важное значение для понимания механизмов нетрадиционного улавливания в VSV.Авторы показывают требования к последовательности для метилирования и цепочку событий, которые характеризуют этот механизм.
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Теста Д. и Банерджи А. К. Две активности метилтрансферазы в очищенных вирионах вируса везикулярного стоматита. J. Virol. 24 , 786–793 (1977).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Текес, Г., Rahmeh, A. A. & Whelan, S. P. Вид с замороженной рамкой транскрипции вируса везикулярного стоматита определяет минимальную длину РНК для 5′-процессинга. PLoS Pathog. 7 , e1002073 (2011).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Ахола Т. и Кяэрияйнен Л. Реакция кэппирования мРНК альфавируса: образование ковалентного комплекса неструктурного белка nsP1 с 7-метил-GMP. Proc. Natl Acad. Sci. США 92 , 507–511 (1995). Открытие нетрадиционного пути кэпирования РНК альфавирусов, в котором метилирование GTP гуанином-N7 предшествует m 7 Перенос GMP на предполагаемую GTase, nsP1.
CAS Статья PubMed Google ученый
Васильева, Л., Меритс, А., Аувинен, П. и Кяэрияйнен, Л. Идентификация новой функции укупорочного аппарата альфавирусов.РНК 5′-трифосфатазная активность Nsp2. J. Biol. Chem. 275 , 17281–17287 (2000).
CAS Статья PubMed Google ученый
Ахола, Т., Лаакконен, П., Вихинен, Х. и Кяэрияйнен, Л. Критические остатки фермента, улавливающего РНК вируса леса Семлики, участвующие в активности метилтрансферазы и гуанилилтрансферазы. J. Virol. 71 , 392–397 (1997).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Li, Y.I., Chen, Y.J., Hsu, Y.H. и Meng, M. Характеристика AdoMet-зависимой гуанилилтрансферазной активности, которая связана с N-концом репликазы вируса мозаики бамбука. J. Virol. 75 , 782–788 (2001).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Merits, A. et al. Вирус-специфическое кэппирование РНК вируса табачной мозаики: метилирование GTP до образования ковалентного комплекса p126- m 7GMP. FEBS Lett. 455 , 45–48 (1999).
CAS Статья PubMed Google ученый
Magden, J. et al. Вирус-специфический фермент, блокирующий мРНК, кодируемый вирусом гепатита E. J. Virol. 75 , 6249–6255 (2001).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Боулой, М., Плотч, С.J. & Krug, R.M. мРНК глобина являются праймерами для транскрипции РНК вируса гриппа in vitro . Proc. Natl Acad. Sci. США 75 , 4886–4890 (1978).
CAS Статья PubMed Google ученый
Caton, A. J. & Robertson, S. Структура последовательностей, полученных от хозяина, присутствующих на 5′-концах мРНК вируса гриппа. Nucleic Acids Res. 8 , 2591–2603 (1980).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Plotch, S.J., Bouloy, M. & Krug, R.M. Перенос 5′-концевой крышки мРНК глобина на комплементарную РНК вируса гриппа во время транскрипции in vitro . Proc. Natl Acad. Sci. США 76 , 1618–1622 (1979).
CAS Статья PubMed Google ученый
Ци, Х.и другие. Связывание кэпа и уклонение от иммунитета, выявленное структурой нуклеопротеина Ласса. Природа 468 , 779–783 (2010).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Бишоп, Д. Х. М. Ю., Гей, М. Э. и Мацуоко, Ю. Невирусные гетерогенные последовательности присутствуют на 5′-концах комплементарной РНК S. bunyavirus S. одного вида зайца-снегоступа. Nucleic Acids Res. 11 , 6409–6418 (1983).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Bouloy, M., Pardigon, N., Vialat, P., Gerbaud, S. & Girard, M. Характеристика 5′- и 3′-концов вирусных матричных РНК, выделенных из клеток BHK21, инфицированных вирусом Germiston (Бунявирус). Вирусология 175 , 50–58 (1990).
CAS Статья PubMed Google ученый
Эшита, Ю., Эриксон, Б., Романовски, В. и Бишоп, Д. Х. Анализ процессов транскрипции мРНК видов S и M РНК буньявируса снежного зайца. J. Virol. 55 , 681–689 (1985).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Паттерсон, Дж. Л., Холлоуэй, Б. и Колакофски, Д. Вирионы Ла Кросса содержат стимулированную праймером РНК-полимеразу и метилированную кэп-зависимую эндонуклеазу. Дж.Virol. 52 , 215–222 (1984).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Garcin, D. et al. 5′-концы РНК вируса Хантаан (Bunyaviridae) предполагают механизм праймирования и перестройки для инициации синтеза РНК. J. Virol. 69 , 5754–5762 (1995).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Джин, Х.& Elliott, R.M. Невирусные последовательности на 5′-концах мРНК S наировируса Дугбе. J. Gen. Virol. 74 , 2293–2297 (1993).
CAS Статья PubMed Google ученый
Raju, R. et al. Не предполагаемые основания на 5′-концах мРНК вируса Такарибе. Вирусология 174 , 53–59 (1990).
CAS Статья PubMed Google ученый
Вебер, Ф., Haller, O. & Kochs, G. Нуклеопротеиновые вирусные РНК и мРНК вируса Тогото: новый механизм «кражи кепки» у клещевых ортомиксовирусов? J. Virol. 70 , 8361–8367 (1996).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Leahy, M. B., Dessens, J. T. & Nuttall, P. A. In vitro полимеразная активность вируса Thogoto: доказательства уникального механизма захвата крышки у клещевого ортомиксовируса. J. Virol. 71 , 8347–8351 (1997).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Guilligay, D. et al. Структурная основа связывания кэпа субъединицей полимеразы вируса гриппа PB2. Nature Struct. Мол. Биол. 15 , 500–506 (2008).
CAS Статья Google ученый
Диас, А.и другие. Эндонуклеаза полимеразы вируса гриппа, захватывающая кепку, находится в субъединице PA. Природа 458 , 914–918 (2009).
CAS Статья Google ученый
Юань, П. и др. Кристаллическая структура полимеразы птичьего гриппа PAN выявляет активный сайт эндонуклеазы. Природа 458 , 909–913 (2009). Вместе со ссылкой 119 в этой статье описываются структурные и функциональные характеристики эндонуклеазы, захватывающей кепку.
CAS Статья Google ученый
Крепен Т. и др. Анализ мутаций и связывания металлов в эндонуклеазном домене субъединицы PA полимеразы вируса гриппа. J. Virol. 84 , 9096–9104 (2010).
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Регера, Дж., Вебер, Ф. и Кьюсак, С.РНК-полимеразы Bunyaviridae (L-белок) имеют N-концевой, гриппоподобный эндонуклеазный домен, необходимый для вирусной кэп-зависимой транскрипции. PLoS Pathog. 6 , e1001101 (2010).
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Morin, B. et al. N-концевой домен белка L аренавируса является эндонуклеазой РНК, необходимой для транскрипции мРНК. PLoS Pathog. 6 , e1001038 (2010).
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Lelke, M., Brunotte, L., Busch, C. & Günther, S. N-концевой участок белка L вируса Ласса играет критическую роль в транскрипции, но не в репликации вирусного генома. J. Virol. 84 , 1934–1944 (2010).
CAS Статья PubMed Google ученый
Кранцуш, П.J. et al. Сборка функционального комплекса вирусной полимеразы Мачупо. Proc. Natl Acad. Sci. США 107 , 20069–20074 (2010).
CAS Статья PubMed Google ученый
Руигрок, Р. В. Х., Крепин, Т., Харт, Д. Дж. И Кьюсак, С. К пониманию атомарного разрешения механизма репликации вируса гриппа. Curr. Opin. Struct. Биол. 20 , 104–113 (2010).
CAS Статья PubMed Google ученый
Хасти, К. М., Кимберлин, С. Р., Зандонатти, М. А., Макрей, И. Дж. И Сапфайр, Е. О. Структура нуклеопротеина вируса Ласса выявляет дцРНК-специфическую 3 ‘- 5’ экзонуклеазную активность, необходимую для подавления иммунитета. Proc. Natl Acad. Sci. США 108 , 2396–2401 (2011).
CAS Статья Google ученый
Мир, м.A., Duran, W.A., Hjelle, B.L., Ye, C. & Panganiban, A.T. Хранение клеточных 5′-колпачков мРНК в P-тельцах для захвата вирусного колпачка. Proc. Natl Acad. Sci. США 105 , 19294–19299 (2008 г.). Статья, которая проливает свет на то, как N-белок связывается преимущественно с кэпированными мРНК, хранит и защищает эти мРНК в P-тельцах и потенциально играет активную роль в приобретении кэп-тельцов.
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Феррон, Ф.и другие. Гексамерная структура нуклеопротеина вируса лихорадки рифтовой долины предполагает механизм его сборки в рибонуклеопротеидные комплексы. PLoS Pathog. 7 , e1002030 (2011).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Кояма С., Исии К. Дж., Кобан С. и Акира С. Врожденный иммунный ответ на вирусную инфекцию. Цитокин 43 , 336–341 (2008).
CAS Статья PubMed Google ученый
Такеучи О. и Акира С. Распознавание вирусов по врожденному иммунитету. Immunol. Ред. 220 , 214–224, (2007).
CAS Статья PubMed Google ученый
Уилкинс, К. и Гейл, М., младший. Распознавание вирусов цитоплазматическими сенсорами. Curr. Opin. Иммунол. 22 , 41–47 (2010).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Йонеяма М. и Фудзита Т. Распознавание вирусных нуклеиновых кислот при врожденном иммунитете. Rev. Med. Virol. 20 , 4–22 (2010).
CAS Статья Google ученый
Бреннан, К. и Боуи, А. Г. Активация рецепторов распознавания образов хозяина вирусами. Curr. Opin. Microbiol. 13 , 503–507 (2010).
CAS Статья Google ученый
Хансен, Дж. Д., Войтех, Л. Н. и Лэйнг, К. Дж. Определение болезни и опасности: обзор PRR позвоночных и их происхождения. Dev. Комп. Иммунол. 35 , 886–897 (2011).
CAS Статья PubMed Google ученый
Мейлан, Э., Tschopp, J. & Karin, M. Рецепторы распознавания внутриклеточного паттерна в ответе хозяина. Природа 442 , 39–44 (2006).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Диболд, С. С., Кайшо, Т., Хемми, Х., Акира, С. и Рейс е Соуза, С. Врожденные противовирусные ответы посредством TLR7-опосредованного распознавания одноцепочечной РНК. Наука 303 , 1529–1531 (2004).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Züst, R. et al. Рибоза 2′- O -метилирование обеспечивает молекулярную сигнатуру для различения собственной и чужой мРНК, зависящей от сенсора РНК Mda5. Nature Immunol. 12 , 137–143 (2011). Авторы впервые показывают роль 2′- O -метилирования в восприятии собственной РНК системой врожденного иммунитета через датчик РНК MDA5.
Артикул CAS Google ученый
Осиуми, Х., Сакаи, К., Мацумото, М. и Сея, Т. Геликаза DEAD / H BOX 3 (DDX3) связывает адаптер RIG-I IPS-1, повышая регуляцию IFN-β- побуждающий потенциал. евро. J. Immunol. 40 , 940–948 (2010).
CAS Статья PubMed Google ученый
Pichlmair, A. et al. RIG-I-опосредованные противовирусные ответы на одноцепочечную РНК, несущую 5′-фосфаты. Наука 314 , 997–1001 (2006). 5′-трифосфат вирусной РНК идентифицирован как главный компонент в опосредованном RIG-I врожденном иммунном ответе хозяина.
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Schmidt, A. et al. 5′-трифосфатная РНК требует структур с парными основаниями для активации передачи противовирусных сигналов через RIG-I. Proc. Natl Acad. Sci. США 106 , 12067–12072 (2009).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Wang, Y. et al. Структурные и функциональные сведения о распознавании паттернов РНК 5′-ppp рецептором врожденного иммунитета RIG-I. Nature Struct. Мол. Биол. 17 , 781–787 (2010).
CAS Статья Google ученый
Лутра, П., Сан, Д., Сильверман, Р.H. & He, B. Активация экспрессии IFN-β вирусной мРНК через РНКазу L и MDA5. Proc. Natl Acad. Sci. США 108 , 2118–2123 (2011).
CAS Статья Google ученый
Li, X. et al. Структурные основы распознавания двухцепочечной РНК RIG-I-подобным рецептором MDA5. Arch. Biochem. Биофиз. 488 , 23–33 (2009).
CAS Статья PubMed Google ученый
Даффис, С.и другие. 2′-O метилирование кэпа вирусной мРНК позволяет избежать ограничения хозяина членами семейства IFIT. Природа 468 , 452–456 (2010). Авторы демонстрируют, что 2′- O -метилирование вирусного кэпа РНК уклоняется от врожденных противовирусных ответов хозяина за счет избегания опосредованного IFIT подавления.
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Пихлмайр, А.и другие. IFIT1 — это противовирусный белок, распознающий 5′-трифосфатную РНК. Nature Immunol. 12 , 624–630 (2011).
CAS Статья Google ученый
Гарцин Д. и Колакофски Д. Новый механизм инициации репликации генома аренавируса Такарибе. J. Virol. 64 , 6196–6203 (1990).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Hong, Z.И Кэмерон, К. Э. Плейотропные механизмы противовирусной активности рибавирина. Прог. Drug Res. 59 , 41–69 (2002).
CAS Статья PubMed Google ученый
Магден, Дж., Кяэрияйнен, Л. и Ахола, Т. Ингибиторы репликации вирусов: последние разработки и перспективы. заявл. Microbiol. Biotechnol. 66 , 612–621 (2005).
CAS Статья PubMed Google ученый
Лим, С.P. et al. Низкомолекулярные ингибиторы, которые избирательно блокируют метилтрансферазу вируса денге. J. Biol. Chem. 286 , 6233–6240 (2011).
CAS Статья PubMed Google ученый
Кузухара, Т., Иваи, Ю., Такахаши, Х., Хатакеяма, Д. и Эчиго, Н. Катехины зеленого чая ингибируют эндонуклеазную активность РНК-полимеразы вируса гриппа А. PLoS Curr. 1 , RRN1052 (2009).
Артикул PubMed PubMed Central Google ученый
Parkes, K. E. B. et al. Использование фармакофорной модели для открытия нового класса ингибиторов эндонуклеаз гриппа. J. Med. Chem. 46 , 1153–1164 (2003).
CAS Статья PubMed Google ученый
Tomassini, J. et al. Ингибирование кэп (m 7 GpppXm) -зависимой эндонуклеазы вируса гриппа 4-замещенными соединениями 2,4-диоксобутановой кислоты. Антимикробный. Агенты Chemother. 38 , 2827–2837 (1994).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Балвей, Л., Сото Рифо, Р., Риччи, Э. П., Децимо, Д. и Олманн, Т. Структурное и функциональное разнообразие вирусных IRES. Биохим. Биофиз. Acta 1789 , 542–557 (2009).
CAS Статья Google ученый
Гуидотти, Л.Г. и Чисари, Ф. В. Нецитолитический контроль вирусных инфекций с помощью врожденного и адаптивного иммунного ответа. Annu. Rev. Immunol. 19 , 65–91 (2001).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Мальмгаард, Л. Индукция и регулирование интерферонов при вирусных инфекциях. J. Interferon Cytokine Res. 24 , 439–454 (2004).
CAS Статья Google ученый
Гараигорта, У.И Chisari, F. V. Вирус гепатита C блокирует эффекторную функцию интерферона, индуцируя фосфорилирование протеинкиназы R. Cell Host Microbe 6 , 513–522 (2009).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Blanc, A., Goyer, C. & Sonenberg, N. Белок оболочки дрожжевого двухцепочечного РНК-вируса L-A ковалентно присоединяется к кэп-структуре эукариотической мРНК. Мол.Клетка. Биол. 12 , 3390–3398 (1992).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Наитов, Х., Танг, Дж., Канади, М., Викнер, Р. Б. и Джонсон, Дж. Э. Вирус L-A с разрешением 3,4 Å обнаруживает архитектуру частиц и механизм декапирования мРНК. Nature Struct. Биол. 9 , 725–728 (2002).
CAS Статья PubMed Google ученый
Пэрриш, С., Resch, W. & Moss, B. Белок вируса осповакцины D10 обладает активностью по удалению мРНК, обеспечивая механизм контроля экспрессии генов хозяина и вируса. Proc. Natl Acad. Sci. США 104 , 2139–2144 (2007).
CAS Статья PubMed Google ученый
МакЛеннан, А.Г. Обезглавливание: поксвирус заставляет РНК терять голову. Trends Biochem. Sci. 32 , 297–299 (2007).
CAS Статья PubMed Google ученый
Гагля, М.М. и Глаунсингер, Б. А. Вирусы и механизм распада клеточной РНК. Wiley междисциплинарный. Rev. RNA 1 , 47–59 (2010).
CAS Статья PubMed Google ученый
Расшифровка процесса кэпирования РНК у бактерий
Кэпинг РНК у эукариот изучается с 1970-х годов, начиная с открытия 5′-7-метилгуанилатных кэпов в лаборатории Шаткина (1). Этот механизм кэппинга включает паузу во время элонгации транскрипции, что позволяет рекрутировать специализированные кэпирующие ферменты для модификации 5′-конца формирующейся РНК.У бактерий, однако, кэппирование РНК наблюдали только в течение последнего десятилетия, когда на некоторых 5′-концах РНК были обнаружены производные кофермента A (CoA) (2) или никотинамидадениндинуклеотида (NAD) (3, 4). Первый механизм бактериального кэппинга был убедительно установлен в 2016 году, когда было обнаружено, что РНК-полимераза (RNAP) может включать кэп в РНК, используя NAD и CoA в качестве неканонических инициирующих нуклеотидов (5). В прошлом году лаборатория Беласко в Нью-Йоркском университете продемонстрировала, что другой тип кэпа, а именно нуклеозидтетрафосфат (Np 4 ), обнаружен на 5′-конце РНК в Escherichia coli (6) в условиях, когда динуклеозидтетрафосфаты (Np 4 N) увеличены.В PNAS Лучано и Беласко (7) демонстрируют способность РНКП E. coli использовать Np 4 N в качестве инициирующего нуклеотида и ее зависимость от промоторной последовательности. В некоторых случаях включение Np 4 N значительно предпочтительнее, чем инициация стандартными NTP. Таким образом, они устанавливают, что РНКП является основным механизмом кэпирования информационной РНК (мРНК) Np 4 , используемым в E. coli , и что кэп включается во время инициации транскрипции, в отличие от механизма добавления постинициирования, используемого у эукариот.
Np
4 Алармоновое кэппирование у бактерий имеет физиологические последствияМножественные молекулы, производные от нуклеотидов, действуют как сигналы стресса, иногда называемые алармонами, во всех трех сферах жизни. Физиологическая роль некоторых из этих алармонов хорошо изучена у бактерий. Например, гуанозинтетрафосфат и пентафосфат, сокращенно (p) ppGpp, представляют собой сигналы, которые трансформируют транскриптом в ответ на изменения доступности питательных веществ, явление, известное как строгий ответ.В ответ на аминокислотное голодание в E. coli , (p) ppGpp резко ингибируют транскрипцию сотен промоторов и активируют транскрипцию сотен других промоторов, связываясь непосредственно с RNAP (8). (p) ppGpp также связывается с большим количеством других ферментов, дополнительно изменяя активность протеома клетки (9). Аналогичным образом, циклический ди-GMP, еще один хорошо охарактеризованный алармон, регулирует множество сигнальных путей, тем самым модулируя вирулентность множества патогенов (10).
Хотя алармоны Np 4 A были обнаружены несколько десятилетий назад как побочные продукты аминоацилирования, и их наличие также широко сохраняется (11), их функции (если таковые имеются) оставались неуловимыми (12). Недавнее открытие кэпов Np 4 на 5′-конце мРНК в E. coli (6) предполагает, что вместо того, чтобы служить регуляторами путем связывания с рецепторами, передача сигналов Np 4 N могла напрямую изменять регуляторный выход модификация мРНК. Группа Беласко показала, что дисульфидный стресс увеличивает уровни Np 4 A за счет ингибирования Np 4 A гидролазы ApaH, тем самым влияя на кэпинг нескольких РНК, что является четкой демонстрацией того, что изменение окружающей среды может изменить кэппирование РНК.В соответствии с этим наблюдением делеция гена apaH привела к накоплению Np 4 A (13) и увеличению кэппинга (6).
Лучано и Беласко (7) показывают, что многие Np 4 As могут очень эффективно использоваться в качестве инициирующих нуклеотидов как in vitro, так и in vivo. Этот механизм кэппинга напоминает NAD и CoA-кэпирование мРНК (5), за исключением того, что для всех протестированных промоторов включение Ap 4 A в качестве инициирующего нуклеотида намного предпочтительнее, чем АТФ (аденозин-5′-трифосфат) в анализах транскрипции in vitro. (7).Другие Np 4 As и даже молекулы с альтернативным количеством мостиковых фосфатов (например, Np 5 As и Np 3 As) также были предпочтительнее АТФ во время инициации транскрипции на некоторых промоторах.
Это отличается от кэпирования NAD и кэпирования CoA, для которых эффективность включения была намного ниже, чем с АТФ в каждом протестированном промоторе (5). Конечно, возможно, что оптимальные условия для кэппирования NAD и CoA 5 ‘еще не определены и что их эффективность включения может достигнуть уровня, наблюдаемого для Np 4 при соблюдении правильных условий.
Детерминанты промотора Np
4 кэпирование N-РНК и регуляция экспрессии геновПоложения промотора от -11 до +2 относительно сайта старта транскрипции являются основными детерминантами эффективности инициации транскрипции. Эта область становится одноцепочечной во время образования открытого комплекса, влияя на несколько этапов механизма (14, 15).
Лучано и Беласко (7) демонстрируют, что положения от -3 до +1 на матричной цепи влияют на включение Np 4 As как in vitro, так и in vivo.Идентичность нуклеотида +1 влияет на то, какие виды Np 4 A могут быть включены, например, любой из четырех Np 4 As, когда +1 является T, и только Ap 4 G, Ap 4 C , или Ap 4 U, когда +1 означает C, G или A соответственно. Идентичность основания при -1, по-видимому, оказывает наибольшее влияние на включение Np 4 A; пиримидин с матричной цепью является очень предпочтительным для включения Np 4 A.
Поскольку авт. Показали, что кэп Np4 влияет на скорость деградации мРНК (6), влияние промоторной последовательности на кэппирование обеспечивает механизм дифференциального изменения экспрессии генов, когда уровни Np4A повышаются.Кроме того, поскольку все протестированные промоторы лучше инициируются с Np 4 A, чем с АТФ in vitro, и есть некоторые промоторы, где инициирующий NTP может ограничивать транскрипцию (16), вполне вероятно, что транскрипция с этих промоторов может также может увеличиваться независимо от влияния на стабильность мРНК, потенциально обеспечивая дополнительный механизм регуляции.
Таким образом, кэппирование Np 4 обеспечивает недооцененный механизм регуляции экспрессии генов у бактерий.По мере дальнейшего изучения его роли кажется вероятным, что он играет роль в ответных реакциях на изменения окружающей среды и питания, которые ранее были необъяснены.
Благодарности
Исследования в R.L.G. Лаборатория поддерживается грантом R01 GM37048 Национального института здравоохранения. J.J. поддерживается докторской стипендией Европейской организации молекулярной биологии (ALTF 1119-2018).
Сноски
Вклад авторов: J.J.и R.L.G. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.
См. Сопутствующую статью на странице 3560 в выпуске 7 тома 117.
определение кепки в The Free Dictionary
n.1. Обычно мягкий и плотно прилегающий головной убор без полей или с козырьком.
2.а. Особый головной убор, используемый для обозначения ранга, занятия или принадлежности к определенной группе: кардинальная шапка; матросская фуражка.
б. Академический миномет. Особенно часто используется во фразе cap and gown.
3.а. Защитная крышка или пломба, особенно закрывающая конец или наконечник: крышка от бутылки; 35-миллиметровая крышка объектива.
б. Коронка для закрытия или пломбирования зуба.
с. Фуражка грузовая.
г. Протектор изношенной пневматической шины.
эл. Прилегающее покрытие, используемое для герметизации колодца или большой трубы.
ф. В основном южные штаты США См. Глаз.4. Вершина или вершина, как гора.
5. Верхний предел; потолок: установлен предел для ставок по ипотеке.
6. Архитектура Капитель колонны.
7. Ботаникаа. Верхняя часть, или пилеус, гриба.
б. Калиптра.
8.а. Капсюль ударный.
б. Небольшой заряд взрывчатого вещества в бумаге для игрушечного пистолета.
9. Писательная бумага любого из нескольких размеров, например бумага для письма.
10. Спорт Появление игрока на международном футбольном матче, традиционно награждаемое шляпой.
тр.в. колпачок , колпачок , колпачок1. Для закрытия, защиты или герметизации колпачком.
2. Чтобы присвоить специальную шапку в знак звания или достижения: ограничивает новых медсестер по окончании учебы.
3. Лежать на или сверху; Покрытие: холмы, покрытые снегом.
4. Чтобы нанести последний штрих; полный: закройте трапезу десертом.
5. Чтобы последовать чему-то лучшему; превзойти или превзойти: завершил свой последний трюк актом исчезновения, который поставил публику на ноги.
6. Установить верхний предел: решил ограничить рост стоимости жизни.
Словарь английского языка American Heritage®, пятое издание. Авторские права © 2016 Издательская компания Houghton Mifflin Harcourt. Опубликовано Houghton Mifflin Harcourt Publishing Company. Все права защищены.
Явление укупорки — обзор
20.4.1 Влияние свойств материала и условий обработки на укупорку таблеток
Укупорка — это один из механических дефектов, которые могут возникнуть в процессе таблетирования, и он может вызвать катастрофический отказ прессовки.Укупорка определяется как отделение верхней или нижней части кривизны таблетки от тела таблетки либо частично, либо полностью. Это может произойти при выталкивании таблетки из матрицы, при последующем обращении или испытании на твердость. Укупорка таблеток может зависеть от свойств материала состава, условий процесса и формы инструмента. В недавней работе, опубликованной Аксели и др., 71,72 , авторы разработали неразрушающий ультразвуковой метод для количественной корреляции параметров материала и процесса с тенденцией к укупорке таблеток.Они изучили различные порошковые смеси с широким диапазоном свойств материалов. Эти смеси состояли из двух модельных лекарств (ацетаминофен (APAP) и аскорбиновая кислота) с разными уровнями либо с хрупкими наполнителями (моногидрат лактозы или Таблеттоза 80), либо с пластически деформирующими наполнителями (микрокристаллическая целлюлоза или Avicel PH 102). Кроме того, они также изучили 10 коммерческих производственных смесей, для которых имелись обширные производственные знания о тенденциях укупорки. Чтобы сравнить тенденцию к укупорке между коммерческими продуктами и экспериментальными смесями, приготовленными в лабораторных масштабах, все смеси уплотняли в одинаковых контролируемых условиях с использованием эмулятора уплотнения Presster.Подсчитывали количество таблеток, которые укупоривались во время выталкивания и испытания на твердость для каждой порошковой смеси, и использовали их для расчета тенденции к укупорке состава. Неразрушающий ультразвуковой тестер использовался для анализа акустических свойств волн давления и сдвига в таблетках, из которых можно было получить упругие свойства, такие как модуль Юнга E (т. Е. Описывает тенденцию материала к деформации вдоль оси при противодействии сил. прикладываются вдоль этой оси) и модуль сдвига G (т. е. описывает тенденцию материала к сдвигу под действием противодействующих сил).Таблетки были протестированы в осевом и радиальном направлениях и безразмерном соотношении EG E = E осевой / E радиальный и EG G = G осевой / G radial были рассчитаны и использованы для отражения изменения упругих свойств в осевом и радиальном направлениях таблеток. Ключевой вывод заключался в следующем: когда отношения EG E и EG G (далее называемые отношениями EG ) приближаются к единице, ожидается, что таблетка будет более однородной, и укупорка будет менее вероятной. : Поскольку соотношение EG отклоняется от единицы, ожидается, что неоднородности в таблетке будут более выраженными, и более вероятно возникновение укупорки.На рис. 20.3 показано время пролета (TOF) для продольных (давление) и поперечных (сдвиг) ультразвуковых импульсов в таблетке, полученных для одного из тестируемых продуктов (Продукт-9), как в осевом, так и в радиальном направлениях для коммерческого продукта. Рассчитанные соотношения E и G , равные 0,98 и 0,95, указывают на отсутствие риска укупорки таблеток этим коммерческим продуктом.
Рисунок 20.3. Сравнение осевого (синяя пунктирная линия) и радиального (красная сплошная линия) TOF продольных (давление) (а) и поперечных (сдвиг) (б) ультразвуковых импульсов в таблетке, полученной для Продукта-9.Рейтинг укупорки этого продукта — 3 (приемлемо). 71
На основании исследования, очень хорошая корреляция между соотношением EG и тенденцией к укупорке таблеток может быть получена среди 26 лабораторных и коммерческих образцов с широким диапазоном свойств материала. Как показано на рис. 20.4, во время выталкивания или испытания на твердость покрытия не наблюдалось, когда соотношение EG больше 0,65, что было определено как зеленая «приемлемая область». Когда коэффициенты EG находятся между 0.45 и 0,65, при испытании на твердость иногда наблюдалась закупорка, которая находилась в желтой «умеренной области». Когда соотношение EG и меньше 0,45, таблетка имеет высокий риск закупоривания, что было показано в розовой области «плохо».
Рисунок 20.4. Неразрушающая ультразвуковая оценка тенденции к укупорке таблеток. Узорчатые и черные полосы представляют EG E = E осевое / E радиальное и EG G = G осевое / G радиальное соответственно. 71
Свойства материалов обычно имеют наиболее значительное влияние на тенденцию к укупорке смесей рецептур. Возьмем, например, смеси APAP. В литературе хорошо известно, что составы, содержащие APAP, склонны к кэппированию из-за плохих характеристик сжатия APAP. 73 Из рис. 20.4 видно, что когда APAP был смешан с Tablettose 80, обычно используемым наполнителем, который подвергается хрупкому разрушению при сжатии, полученная порошковая смесь проявляла высокую тенденцию к закупориванию, когда загрузка APAP составляла всего 5%. .Однако, когда APAP смешивали с микрокристаллической целлюлозой, другим обычно используемым наполнителем, который претерпевает пластическую деформацию во время сжатия, полученная смесь не проявляла тенденции к улавливанию даже при загрузке лекарственного средства 20%. Когда тестировали другое модельное лекарство, аскорбиновую кислоту, бинарные смеси с Таблеттозой 80, содержащие 1–10% API, не проявляли тенденции к улавливанию. Однако, когда загрузка лекарственного средства была увеличена до 20%, наблюдалась высокая тенденция к закупорке. Подобно примеру APAP, использование пластически деформируемого наполнителя (MCC) может выдерживать гораздо более высокую лекарственную нагрузку, чем хрупкий наполнитель Tablettose 80.При 40% -ной загрузке лекарственного средства проблемы с укупоркой отсутствовали при использовании бинарных смесей аскорбиновой кислоты и МКЦ. При 60% -ной лекарственной нагрузке возникла проблема умеренного укупоривания. При 80% -ной лекарственной нагрузке риск кэппинга был значительно выше. Эти примеры не только иллюстрируют необходимость понимания влияния свойств материала на технологичность продукта (т. Е. Укупорку), но также и важность выбора подходящих наполнителей во время разработки рецептуры, чтобы учесть нежелательные свойства материала лекарственного вещества.
Помимо свойств материала, технологические параметры также могут существенно повлиять на тенденцию к укупорке таблеток. В последующем исследовании Akseli et al. систематически исследовали влияние условий обработки на один и тот же набор образцов. DOE (d-оптимальный дизайн отклика поверхности) использовался для изучения влияния трех факторов на тенденцию к покрытию таблеток, то есть формы инструмента (круглая, скошенная кромка, овальная форма), силы сжатия (5, 10, 15, 20, 25 кН), и скорость сжатия (25, 40, 80 об / мин). В этой работе критерии риска ограничения были уточнены, чтобы указать различные регионы с соотношением EG : бедная / ограниченная область: EG <0.4, область высокого риска: 0,4 < EG <0,5, область низкого риска: 0,5 < EG <0,6, приемлемая область: EG > 0,6. Влияние условий обработки можно проиллюстрировать с помощью коммерческих продуктов 1 и 2 на рис. 20,5 и 20,6. Как показано на рисунках, Продукт 1 имеет умеренный риск образования укупорки, а Продукт 2 не имеет тенденции к укупорке. Наблюдения, сделанные во время исследований сжатия с использованием пресса в лаборатории, согласуются с опытом производства коммерческих продуктов.Поскольку Продукту 1 свойственна тенденция к укупорке, особенно важно понимать, как переменные обработки могут повлиять на риск укупорки таблетки. Как показано на рис. 20.5, форма инструмента имеет наиболее выраженное влияние на тенденцию к закупориванию таблеток с инструментами овальной формы> инструментами со скошенными краями> круглыми инструментами. Таблетки овальной формы имеют умеренный или высокий риск закупоривания при всех изученных условиях. Таблетки со скошенными краями показали себя немного лучше, чем таблетки овальной формы, с точки зрения риска закупоривания.Тем не менее, все таблетки, изготовленные с использованием инструментов со скошенной кромкой, по-прежнему демонстрируют умеренный или высокий риск закупоривания при любых условиях. Круглые таблетки предлагают лучшую возможность минимизировать риск закупоривания. Таблетки, изготовленные с использованием круглых инструментов, имеют приемлемый риск закупоривания там, где сила сжатия очень мала. В отличие от Продукта 1 свойства материала Продукта 2 более желательны с приемлемым риском закупоривания. Риск закупоривания низок в гораздо большем производственном пространстве, где можно изменять параметры процесса.Как и в случае с Продуктом 1, заметное влияние формы таблеточной оснастки на тенденцию к закупориванию наблюдали с тем же порядком ранжирования: овальная форма> скошенная кромка> круглая оснастка. Область безопасного процесса является самой широкой для круглых инструментов и самой маленькой для инструментов овальной формы. Следует отметить, что даже несмотря на то, что Продукт-2 имеет отличные свойства материала с точки зрения риска укупорки, укупорка таблетки все же может происходить при определенных условиях процесса.
Рисунок 20.5. Трехмерные графики поверхности и двухмерные контуры соотношения EG в зависимости от силы сжатия в зависимости от скорости сжатия для таблеток круглой (а), скошенной кромки (б) и овальной формы (в), изготовленных с использованием смеси Продукт-1. EG Соотношение в зависимости от пористости таблеток для Продукта-1 (d), изготовленного с круглой (круг), скошенной кромкой (треугольник) и овальной (квадратной) формой — бедная / покрывающая область: EG & lt; 0,4, область высокого риска: 0,4 & lt; EG & lt; 0,5, область низкого риска: 0,5 & lt; EG & lt; 0,6, приемлемая область: EG & gt; 0,6. 72
Рисунок 20.6. Трехмерные графики поверхности и двухмерные контуры соотношения EG в зависимости от силы сжатия в зависимости от скорости сжатия для таблеток круглой (а), скошенной кромки (б) и овальной формы (в), изготовленных с использованием смеси Продукт-1. EG Соотношение в зависимости от пористости таблеток для Продукта-2 (d), изготовленного с круглой (круг), скошенной кромкой (треугольник) и овальной (квадратной) формой инструмента — бедная / покрывающая область: EG & lt; 0,4, область высокого риска: 0,4 & lt; EG & lt; 0,5, область низкого риска: 0,5 & lt; EG & lt; 0,6, приемлемая область: EG & gt; 0,6. 72
Общие выводы из этого тематического исследования показывают (1) как свойства материала, так и параметры обработки могут иметь значительное влияние на качество и производство таблеток.Следовательно, важно оценить потенциальное влияние свойств материала, переменных процесса и их взаимодействия на качество продукции и производство во время проектирования и разработки продукта и процесса; (2) для составов со свойствами материала, подверженными рискам обработки, варианты минимизации или устранения риска путем изменения условий процесса часто ограничены. Для составов с улучшенными свойствами материалов понимание процесса по-прежнему имеет решающее значение для разработки надежного производственного процесса; (3) быстрые и экономичные инструменты прогнозирования, такие как ультразвуковой укупорочный тест, могут использоваться для ранней оценки и прогнозирования рисков, облегчения разработки продуктов и процессов с улучшенным пониманием CMA и параметров процесса, а также для разработки стратегии снижения рисков.
WordReference Random House Полный словарь американского английского языка © 2021 cap • ping (кап ′ ing), США произношение n. [Горное дело.]
WordReference Словарь американского английского языка для учащихся Random House © 2021 cap 1 / kæp / USA произношение п., в., колпачок, колпачок • пинг. п. [счетный]
v.[~ + Объект]
крышка 3 / kæp / USA произношение п.[счетно]
-cap- корень. WordReference Random House Полный словарь американского английского языка © 2021 cap 1 (кап), США произношение n., V., capped, cap • ping. п.
в.т.
в.и.
колпачок 2 (кап), США произношение n., V., capped, cap • ping.
в.т.
колпачок 3 (кап), США произношение n.[Сленг.]
КРЫШКА,
Краткий английский словарь Коллинза © HarperCollins Publishers :: шапочка / kæp / n
ˈcapper n ‘ capping ‘ также встречается в этих записях (примечание: многие из них не являются синонимами или переводами): |
мРНК: биологические функции и применение | Исследование нуклеиновых кислот
Аннотация
5′-кэп m7G представляет собой эволюционно консервативную модификацию мРНК эукариот.Десятилетия исследований показали, что кэп m7G служит уникальным молекулярным модулем, который рекрутирует клеточные белки и опосредует связанные с кэпом биологические функции, такие как процессинг пре-мРНК, ядерный экспорт и зависимый от кэп-белка синтез. Только недавно стала ясна роль метилирования cap 2’O как идентификатора собственной РНК в системе врожденного иммунитета против чужеродной РНК. Открытие механизма кэпирования цитоплазмы предполагает новый уровень сети управления. Эти новые открытия подчеркивают важность правильной структуры кэпа в синтезе функциональной информационной РНК.В этом обзоре мы суммируем текущие знания о биологической роли кэпов мРНК в эукариотических клетках. Мы также обсудим различные средства, которые вирусы и их клетки-хозяева используют для ограничения своей РНК, и применение этих механизмов для синтеза функциональной мРНК. Также будут обсуждаться новые применения ферментов кэпирования РНК для открытия новых видов РНК и секвенирования транскриптома микробиома. Мы закончим резюме новыми открытиями в области кэппирования РНК и вопросами, которые ставят эти открытия.
ВВЕДЕНИЕ
Вся мРНК эукариот содержит кэп-структуру — N7-метилированный гуанозин, связанный с первым нуклеотидом РНК через обратную 5′-5′-трифосфатную связь (рис. 1). Помимо своей важной роли в кэп-зависимом инициировании синтеза белка, кэп мРНК также функционирует как защитная группа от 5 ‘до 3’ расщепления экзонуклеазой и уникальный идентификатор для привлечения белковых факторов для сплайсинга пре-мРНК, полиаденилирования и ядерного экспорта. .Он также действует как якорь для набора факторов инициации, которые инициируют синтез белка и образование петли мРНК с 5 ‘на 3’ во время трансляции. Недавние исследования показали, что 2’O-метилирование +1 нуклеотида (структура кэпа 1; рис. 1) является центральным для несамодискриминационного ответа врожденного иммунитета против чужеродной РНК (1). Структурные исследования пролили свет на структурную основу такой дискриминации (2). Недавняя характеристика цитоплазматического (ре) -кэппингового комплекса добавила потенциально новый уровень контроля над синтезом белка и регуляторной сетью на основе РНК (3).
Рисунок 1.
Рисунок 1.
Превосходные обзоры биологических ролей m7G cap 0 и cap 1 у эукариот и механизмов кэпирования вирусной РНК доступны в литературе (4,5). В этом обзоре мы дадим обновленную информацию в этих областях с акцентом на молекулярную основу врожденного иммунитета против не-кэп-1 5′-структур, цитоплазматическое повторное кэппирование и механизмы контроля качества кэпов. Мы также обсудим, как мы можем использовать механизмы вирусного кэппинга для синтеза функциональной мРНК и как ферменты кэпирования РНК могут помочь обнаружить новые виды РНК и секвенировать транскриптом микробиома.В заключение мы рассмотрим вопросы, которые новые открытия в области кэппирования РНК ставят перед более широким научным сообществом.
кэппинг мРНК у эукариот
Кеппинг ядерной РНК
Кэппирование является первой модификацией РНК, транскрибируемой РНК-полимеразой II, и происходит котранскрипционно в ядре, как только первые 25–30 нуклеотидов включаются в зарождающийся транскрипт (6,7). Для создания структуры cap 0 требуются три ферментативные активности, а именно РНК-трифосфатаза (TPase), РНК-гуанилилтрансфераза (GTase) и гуанин-N7-метилтрансфераза (гуанин-N7-МТаза) (Таблица 1).Каждая из этих ферментных активностей выполняет важную стадию превращения 5′-трифосфата образующейся РНК в структуру cap 0. РНК-ТПаза удаляет γ-фосфат из 5′-трифосфата с образованием 5′-дифосфатной РНК (рис. 2, реакция 1). GTase передает группу GMP от GTP к 5′-дифосфату через ковалентный промежуточный продукт лизин-GMP (рис. 2, реакции 2.1 и 2.2). Затем гуанин-N7 МТаза добавляет метильную группу к амину N7 гуанинового колпачка с образованием структуры кэп 0 (рис. 2, реакция 3).Кроме того, m7G-специфическая 2’O-метилтрансфераза (2’O-МТаза) метилирует +1 рибонуклеотид в положении 2’O рибозы с образованием структуры cap 1 (рис. 2, реакция 4).
Рисунок 2.
Ферментативные этапы, участвующие в кэппировании РНК. Активность РНК-трифосфатазы (TPase) удаляет γ-фосфат из 5′-трифосфата, образуя 5′-конец дифосфата и неорганический фосфат (реакция [1]). Активность гуанилилтрансферазы (GTase) поглощает молекулу GTP и образует ковалентный промежуточный продукт, содержащий лизил-Nζ-5′-фосфогуанозин (реакция [2.1]). В присутствии 5′-дифосфатной РНК активность GTase переносит 5′-фосфогуанозин (GMP) в 5′-дифосфат, образуя 5′-5′-трифосфатную связь между первым основанием РНК и кэпирующим основанием (реакция [2.1]). В присутствии S-аденозилметионина (SAM) активность гуанин-N7-метилтрансферазы (МТаза) добавляет метильную группу к амину N7 гуанозинового кэпа с образованием структуры кэп 0 (реакция [3]). Наконец, m7G cap-специфическая 2’O MTase модифицирует 2’O +1 рибозы и генерирует структуру cap 1 (реакция [4]).
Рисунок 2.
Ферментативные этапы, участвующие в кэппировании РНК. Активность РНК-трифосфатазы (TPase) удаляет γ-фосфат из 5′-трифосфата, образуя 5′-конец дифосфата и неорганический фосфат (реакция [1]). Активность гуанилилтрансферазы (GTase) поглощает молекулу GTP и образует ковалентный промежуточный продукт, содержащий лизил-Nζ-5′-фосфогуанозин (реакция [2.1]). В присутствии 5′-дифосфатной РНК активность GTase переносит 5′-фосфогуанозин (GMP) в 5′-дифосфат, образуя 5′-5′-трифосфатную связь между первым основанием РНК и кэпирующим основанием (реакция [2.1]). В присутствии S-аденозилметионина (SAM) активность гуанин-N7-метилтрансферазы (МТаза) добавляет метильную группу к амину N7 гуанозинового кэпа с образованием структуры кэп 0 (реакция [3]). Наконец, m7G cap-специфическая 2’O MTase модифицирует 2’O +1 рибозы и генерирует структуру cap 1 (реакция [4]).
Разнообразие машин для кэпирования РНК
Таблица 1.Разнообразие оборудования для кэппирования РНК
Разнообразие механизмов для укупорки РНК
Хотя эти ферментативные активности сохраняются у эукариот, конфигурация механизмов укупорки различается. В Saccharomyces cerevisiae три отдельных белка (Cet1, Ceg1 и Abd1) осуществляют индивидуальную активность (8). У многоклеточных животных РНК-ТПаза расположена на N-конце бифункциональной протеиновой РНК-гуанилилтрансферазы и 5′-трифосфатазы RNGTT (Mce1 у мышей), где GTase расположена на С-конце (9,10).Отдельный белок Hcm1 несет активность МТазы гуанин-N7 (11). Недавно были идентифицированы человеческие ферменты, которые метилируют положение 2’O +1 и +2 рибозы с образованием структур cap 1 и cap 2 соответственно (12, 13).
Впервые описанный у дрожжей, а затем продемонстрированный на клетках млекопитающих, ядерный фермент кэпирования РНК взаимодействует с субъединицей полимеразы комплекса РНК-полимеразы II по фосфорилированному Ser5 С-концевых гептадных повторов (14–16). РНК-гуанин-N7-метилтрансфераза также взаимодействует с фосфорилированными гептадными повторами РНК-полимеразы II (обзор см. В (17)).
В S. cerevisiae комплексы Cet1 и Ceg1 уравновешиваются между гетеротримерными (Cet1 2 Ceg1) и гетеротетрамерными (Cet1 2 Ceg1 2 ) формами in vitro (18). Недавнее сообщение о полученной из крио-ЭМ модели активного транскрибирующего ферментного комплекса, блокирующего РНК-полимеразу II, показало, что гетеротетрамерная форма является основным видом, который взаимодействует с РНК-полимеразой (8). Хотя взаимодействие между Ceg1 и фосфорилированным RNAP II CTD было хорошо изучено (16,19), исследование cryo-EM показало, что Cet1 также формирует обширные взаимодействия с транскрибирующим комплексом РНК-полимеразы II вне CTD.Ceg1, по-видимому, является мобильным и принимает несколько конформаций в транскрибирующем комплексе. Также наблюдались контакты с субъединицей Rpb7 RNAP (8).
Цитоплазматическая РНК (ре) -каппинг
Ранее считалось, что кэппирование РНК происходит исключительно в ядре, но сообщалось о цитоплазме клеток млекопитающих и трипаносомах. Эукариотические клетки поддерживают цитоплазматический пул незаполненной мРНК в форме рибонуклеопротеина-мессенджера (мРНП) в Р-тельцах, где могут иметь место хранение, деаденилирование и декапирование мРНК (20–22).Незакрепленная мРНК в P-тельцах может повторно входить в полисомы и транслироваться (21). Интересно, что длина поли (А) хвоста мРНП в Р-тельцах может становиться короче, длиннее или неизменной для разных мРНК, а способность повторно входить в полисому зависит от наличия кэпа, но не от длины поли (А). хвост (23). Было обнаружено, что из клеток OS-2 остеосаркомы человека цитоплазматический кэпирующий комплекс, состоящий из RNGTT, 5′-монофосфаткиназы и Nck1, повторяет 5′-монофосфатную РНК in vitro (3,24,25) (Таблица 1).В то время как большинство повторно кэпированных РНК картируется на 5′-сайты CAGE, около 25% из них картируются на внутренние сайты CAGE (26,27) и короткие РНК, ассоциированные с промотором (PASR) (27,28). Это подтверждает представление о том, что некоторые из PASR являются процессируемыми транскриптами, кэпированными в цитоплазме (28). В Trypanosoma brucei недавно был идентифицирован бифункциональный фермент TbCe1, который фосфорилирует 5′-монофосфат и блокирует образующуюся дифосфатную РНК в цитоплазме (29). In vitro , TbCe1 предпочитает РНК, содержащую T.brucei лидерная последовательность сплайсинга, содержащая 2’O-метилирование в первых 4 нуклеотидах, что позволяет предположить, что ранее гиперметилированная и декапированная мРНК T. brucei является предпочтительным субстратом in vivo (29).
Цитоплазматическая система повторного кэпинга может представлять собой новый механизм инактивации-реактивации мРНК, который помогает регулировать синтез белка (29,30). Повторное копирование внутренних сайтов CAGE и некодирующих РНК, таких как PASR, предполагает роль кэпа в неожиданном разнообразии белковых продуктов и пока неизвестных регуляторных сетях, соответственно (24,26).
Система контроля качества крышек
Сплайсинг и полиаденилирование пре-мРНК были связаны с недавно охарактеризованным механизмом контроля качества кэпов. В клетках млекопитающих описан трифункциональный белок DXO / Dom3Z, который обладает активностью декапирования, пирофосфогидролазы и 5′-3′-экзонуклеазой (31). Фермент специфически декапирует неметилированный кэп (GpppN) и разрушает полученную 5′-монофосфатную РНК, используя свою 5′-3′-экзонуклеазную активность. Нокдаун DXO / Dom3Z приводит к увеличению уровня пре-мРНК, но не к зрелой мРНК с метил-кэпом, что позволяет предположить, что фермент активно удаляет кэпированные, но неметилированные пре-мРНК из клеток.Нокдаун также приводит к дефектному сплайсингу первого и последующих интронов, а также к дефектному расщеплению 3′-сайта полиаденилирования in vivo (31), демонстрируя связь между метилированием кэпа N7 и сплайсингом пре-мРНК и полиаденилированием.
Было обнаружено, что Saccharomyces cerevisiae обладает двумя наборами частично дублирующих механизмов для контроля качества шапки РНК. В системе Rai1 – Rat1 Rai1 обладает пирофосфатазной и декапирующей активностью (32). Он взаимодействует с Rat1, дрожжевым гомологом XRN2 млекопитающих, и стимулирует активность экзорибонуклеазы Rat1 (32–34).Кроме того, S. cerevisiae кодирует Dxo1, который обладает как декапирующей, так и 5′-3′-экзонуклеазной активностью (34). В то время как дрожжевые клетки ΔRai1 демонстрируют значительное накопление неметилированной кэпированной РНК только во время глюкозного или аминокислотного голодания (32), дрожжевые клетки ΔRai1ΔDox1 накапливают неметилированную кэпированную РНК в нормальных условиях роста (34).
Биологическая роль крышки m7G
Кепка m7G играет важную роль в координации различных функциональных процессов, которые происходят на протяжении жизненного цикла мРНК.Это в значительной степени объясняется белковыми факторами, которые специфически связываются со структурой кэпа: комплексом связывания кэпа (CBC) в ядре и eIF4E в цитоплазме.
В ядре: процессинг мРНК и ядерный экспорт
Впервые показано в клеточном экстракте HeLa (35,36), а затем в других системах млекопитающих (37) и S. cerevisiae (38), кэп m7G необходим для эффективного сплайсинга пре-мРНК. Это опосредуется посредством набора и связывания с ядерным кеп-связывающим комплексом (CBC), который управляет такими процессами, как сборка сплайсосом, 3′-процессинг, экспорт РНК, биогенез miRNA и нонсенс-опосредованный распад.Состав и функции CBC были рассмотрены в другом месте (39–41). Здесь мы сосредоточимся на кэп-опосредованном процессинге мРНК и ядерном экспорте.
In vivo мРНК взаимодействует с белковыми факторами на протяжении всего своего жизненного цикла и должна рассматриваться как информационный рибонуклеопротеин (мРНП). CBC, состоящий из CBP80 и CBP20, котранскрипционно связывается с кэпом m7G как гетеродимер CBP80 / 20. Связанный кэп-CBC затем образует комплекс с мяРНП U4 / U6 · U5 и инициирует сплайсинг (42).CBC также вносит вклад в процессинг 3′-конца пре-мРНК — связанный с кэпом CBC, ко-иммунопреципитированный с 3′-процессинговыми факторами, связанными с сайтом полиаденилирования (43). Истощение CBC из ядерного экстракта клеток HeLa ослабляет стадию эндонуклеолитического расщепления полиаденилирования, которая может быть восстановлена добавлением рекомбинантного CBC (43). Благодаря взаимодействию с CBC кэп также участвует в терминации транскрипции и экзосомальной деградации (44). Эти находки подчеркивают центральную роль структуры кэпа в рекрутировании множественных белковых комплексов, которые влияют на результат сплайсинга мРНК и образования 3′-конца.
Хотя взаимодействие CBC с кэпом m7G необходимо для экспорта мРНК в S. cerevisiae , оно необходимо для ядерного экспорта у высших эукариот (45). Направленный выход мРНК с 5′-концом впереди (46) приписывается взаимодействию CBC с многочисленными ядерными факторами экспорта, такими как REF (фактор экспорта РНК, также известный как Aly) комплекса экспорта транскрипции TREX ( 47). Взаимодействие CBC, связанного с кэпом, с REF, который также взаимодействует с комплексом соединения экзонов, у позвоночных зависит от сплайсинга (48).Эти факторы экспорта прямо или косвенно взаимодействуют с комплексом ядерных пор (NPC) и направляют полезную нагрузку мРНП в цитоплазму. Для получения дополнительных сведений о механизмах процессинга мРНК, ядерного экспорта и его регуляции мы отсылаем читателя к этим недавним обзорам (41,49,50).
В цитоплазме: инициация трансляции и псевдо-циркуляризация мРНК
Большая часть трансляции клеточной мРНК инициируется кэп-зависимым механизмом. После выхода в цитоплазму CBC остается связанным с кэпом мРНК и рекрутирует eIF4G и РНК-геликазу eIF4A на 5′-конец мРНК.Дальнейшее привлечение других факторов инициации, таких как кэп-связывающий белок CBP80 / 20-зависимый фактор инициации трансляции (CTIF), eIF3g и eIF4III, Met-tRNAi и две рибосомные субъединицы инициируют CBC-зависимый пионерный раунд трансляции, где нонсенс-опосредованный имеет место распад (51–56). После первого раунда трансляции происходит ремоделирование комплекса инициации мРНП. Импортин (IMP) -β связывается с IMP-α, стабильным партнером по связыванию CBC, связанным с кэпом, и инициирует замену CBC на eIF4E, который взаимодействует с комплексом eIF4F и запускает стационарные циклы трансляции (55,57 ).В последнее время достижения в области криоэлектронной топографии позволили визуализировать субклеточные структуры, включая полисомы. Связанные с ER рибосомы четко сгруппированы в тандемные группы как полисомы, где каналы входа и выхода мРНК соседних рибосом выровнены, чтобы обеспечить плавное прохождение мРНК (58).
При связывании с кэпом мРНК, eIF4G комплекса eIF4F взаимодействует с поли (A) связывающим белком PABP1, связанным с поли (A) хвостом мРНК, и создает псевдокруговую структуру транслирующей мРНК (59,60).Было высказано предположение, что псевдо-циркуляризация мРНК помогает гарантировать, что полноразмерные мРНК транслируются и повышают процессивность рибосомы (61,62). По сути, кэп m7G является уникальным якорем на мРНК, где белковые факторы связываются и управляют связанными с кэпом функциями мРНП.
2’O метилированный кэп (кэп 1) как сигнатура собственной РНК
Хотя известно, что структура m7G cap 0 необходима для эффективной трансляции мРНК (63), биологическая роль 2’O метилирования, помимо повышения регуляции трансляции мРНК c-mos во время созревания ооцита (64), остается неясной. пока недавняя работа не продемонстрировала, что клеточные сенсоры RIG-I и MDA5 и эффекторы IFIT1 и IFIT5 интерферонового пути типа I действуют, отделяя РНК cap 1 от других.
Цитоплазматические рецепторы распознавания образов (PRR) RIG-I и RIG-I-подобный рецептор MDA5 являются сенсорами, которые запускают реакцию клеточного интерферона I типа (IFN) на вирусные инфекции (65). В то время как MDA5 взаимодействует с длинной дцРНК (66–70), RIG-I сильно взаимодействует с короткой дцРНК и в меньшей степени с 5′-ppp и 5′-pp ssRNA (71–75). Наиболее важно то, что структура cap 1 устраняет взаимодействия дцРНК с RIG-I и MDA5 и, следовательно, не активирует сигнальный путь IFN (68,76).
Неожиданно, дцРНК cap 0 и 5′-ppp связываются с RIG-I с аналогичной аффинностью (2).Вместо этого 2’O-метилирование 5′-ppp РНК (5′-ppp (2’OMe) N…) значительно снижает связывание дцРНК с передачей сигналов RIG-I и IFN. Взаимодействие с RIG-I и индукцией нижестоящего INF дополнительно ослабляется полной структурой cap 1 (2,76). Фактически, кристаллическая структура RIG-I в комплексе с cap 0 РНК показала, что RIG-I имеет многочисленные контакты с 5′-трифосфатом, но не со структурой cap (2). Мутация His830, который находится в непосредственной близости от 2’ОН нуклеотида +1, в аланин придает RIG-I скорость оборота АТФазы, аналогичную скорости оборота АТФазы WT RIG-I на неметилированной дцРНК, и запускает ответ INF (2).Это продемонстрировало, что RIG-I использует His830 в качестве стерических ворот для дискриминации РНК cap 1.
IFN индуцирует экспрессию и ассоциацию комплекса IFIT, который блокирует трансляцию мРНК, лишенной метилирования 2’O, что приводит к ингибированию репликации вирусной РНК (77–81). Вирус Западного Нила ((+) геном оцРНК), лишенный активности 2’O МТазы, ослаблялся в первичных клетках и мышах, но был вирулентным в клетках с дефектным сигнальным путем IFN (1). IFIT1 и IFIT5, два из компонентов комплекса IFIT, сильно взаимодействуют с 5′-ppp ssRNA (77,81).Подобно RIG-I, кристаллические структуры IFIT5 в комплексе с 5′-ppp ssRNAs показали, что белок взаимодействует прямо и косвенно с 5′-фосфатами, что согласуется с его высокоаффинными взаимодействиями с 5′-p, 5′-ppp и cap. 0 ssRNA, но не с cap 1 ssRNA (78).
Приведенные выше данные подтверждают гипотезу о том, что RIG-I и MDA5 являются вышестоящими сенсорами и что комплекс IFIT является двойным сенсором-эффектором врожденной защитной системы, которая нацелена на чужеродную РНК без надлежащих 5′-модификаций.Врожденный иммунный ответ, построенный против РНК без метилирования 2’O по ее кэпу, убедительно свидетельствует о том, что это метилирование 2’O является сигнатурой собственной РНК (1). Более подробные обзоры биологической роли белков IFIT, RIG-I и MDA5 можно найти в литературе (79,82).
Ферментативная активность, участвующая в кэппировании РНК
Преобразование РНК-транскрипта в cap 0 РНК требует трех последовательных ферментативных стадий: удаление 5′-концевого γ-фосфата с помощью РНК-трифосфатазной активности (TPase), перенос GMP-группы на полученный дифосфатный 5′-конец с помощью РНК-гуанилилтрансферазы активности (GTase) и модификации N7-амина гуанозинового кэпа за счет гуанин-N7-метилтрансферазной активности (MTase) (рис. 2).
Активность РНК-трифосфатазы
РНК-трифосфатаза, классифицируемая как полинуклеотид-5′-фосфатаза (EC 3.1.3.33), превращает концевой трифосфат полирибонуклеотидов в дифосфат (реакция 1, рис. 2) и гидролизует рибонуклеозидтрифосфат в дифосфат in vitro . Две структурно и механически различные группы ферментов осуществляют связанную с кэпом активность РНК-ТПазы.
У многоклеточных животных РНК-трифосфатаза не зависит от ионов двухвалентных металлов и неизменно физически связана с активностью GTase в бифункциональном белке (Mce1 у мышей; обычно известная как РНК-гуанилилтрансфераза и 5′-трифосфатаза RNGTT у млекопитающих).Эти металл-независимые РНК-ТПазы содержат консервативный мотив HCXXXXXR (S / T) суперсемейства цистеинфосфатаз, которое включает протеинтирозинфосфатазы и фосфоинозитидфосфатазы. Консервативный цистеин расположен около дна глубокой щели и образует ковалентный цистеинил-фосфоферментный промежуточный продукт с γ-фосфатом во время разрыва β-γ фосфоангидридной связи. Предполагается, что глубокая щель в активном центре позволяет ферменту дифференцировать концевой 5′-трифосфат от 5′-дифосфата РНК (83).
РНК-ТПаза низших эукариот и большинство ферментов, улавливающих ДНК-вирусы, зависят от ионов двухвалентных металлов для катализа (4,84,85). Доступные кристаллические структуры показывают, что эти TPазы разделяют туннельную структуру β-бочонка, в которой происходит катализ. Структура β-цилиндра является определяющим структурным и каталитическим модулем трифосфатных туннельных металлозимов (ТТМ), предпочтительные субстраты которых неизменно содержат трифосфатную группу. Помимо РНК-ТПаз, они включают бактериальную аденилатциклазу класса IV cyaB, тиаминтрифосфатазы млекопитающих (86,87) и неорганические полифосфатазы (88–90).Биохимические и структурные данные свидетельствуют о том, что разные нуклеофилы участвуют в разных ферментах, но эти TTM разделяют консервативную особенность координации ионов металлов отрицательно заряженными аминокислотными остатками, а также позиционирования и стабилизации γ-фосфата положительно заряженными остатками (91). Мутация заряженных остатков, выстилающих туннель прототипной РНК-TPase Cet1 из S. cerevisiae , приводит к потере активности TPase in vitro и к летальному фенотипу (84,92).
Активность РНК-гуанилилтрансферазы
РНК-гуанилилтрансфераза, официально известная как GTP-РНК-гуанилилтрансфераза (EC2.7.7.50), переносит фрагмент GMP с GTP на 5′-дифосфат РНК, процессируемой TP-азой, образуя кэпированный 5′-конец. РНК-GTазы относятся к подсемейству нуклеотидилтрансфераз, которое включает АТФ- и NAD + -зависимые ДНК-лигазы (93). Этот класс нуклеотидилтрансфераз структурно и механически консервативен во всех сферах жизни.Они катализируют лигирование нуклеиновых кислот посредством двухэтапного механизма, который включает ковалентный промежуточный продукт, связанный с лизил-Nζ, и образование 5′-5′-фосфо (дезокси) рибозного продукта.
Для РНК GTases остатки лизина в мотиве Kx (D / N) G осуществляют нуклеофильную атаку на α-фосфат GTP, разрывая α-β фосфоангидридную связь и образуя ковалентный промежуточный лизил-Nζ-GMP ( Рисунок 2, Реакция 2.1) (94,95). Затем фрагмент GMP переносится на 5′-дифосфат с образованием кэпированной G (5 ‘) ppp (5’) РНК (рис.2, реакция 2.2). Реакция GTase очень напоминает первые две стадии реакции, катализируемой АТФ- и NAD + -зависимыми ДНК-лигазами (5′-аденилилирование ДНК). После образования ковалентного промежуточного соединения лизил-Nζ-AMP эти лигазы переносят фрагмент AMP на 5′-монофосфат ДНК, образуя аденилированную A (5 ‘) pp (5’) ДНК.
Интересной особенностью реакции GTase является ее высокая обратимость. Подробное кинетическое и термодинамическое исследование GTase вируса хлореллы показало, что в отсутствие кэп-акцептирующей РНК обратная реакция первой половины реакции (самогуанилилирование фермента; рисунок 2, реакция 2.1) может протекать с более низкой концентрацией субстрата и с гораздо большей скоростью, чем прямая реакция (96) (рис. 3). С другой стороны, константа скорости второго порядка прямой реакции второй половины реакции (перенос GMP на ppRNA; рисунок 2, реакция 2.2) в 10 раз выше, чем у обратной реакции (рисунок 3). , предполагая, что присутствие РНК, принимающей кэп, способствует развитию реакции GTase.
Рисунок 3.
Реакция гуанилилтрансферазы.Реакция GTase состоит из двух стадий: самогуанилилирование белка и перенос группы GMP на 5′-дифосфатную РНК. Реакция GTase, катализируемая кэпирующим ферментом PBCV-1 вируса хлореллы, очень обратима. Детальное исследование кинетики прямой и обратной реакции обеих стадий показало, что в отсутствие РНК-субстрата значение k cat / K m обратной реакции первой стадии (пирофосфолиз лизил- Промежуточное соединение Nζ-5′-фосфогуанозина в лизин и GTP) в 120 раз выше, чем в прямой реакции.Второй этап (перенос GMP-фрагмента с лизил-Nζ-5′-фосфогуанозина на 5′-конец дифосфата) является в значительной степени перспективным, с 10-кратной разницей в k cat / K м значения (96).
Рисунок 3.
Реакция гуанилилтрансферазы. Реакция GTase состоит из двух стадий: самогуанилилирование белка и перенос группы GMP на 5′-дифосфатную РНК. Реакция GTase, катализируемая кэпирующим ферментом PBCV-1 вируса хлореллы, очень обратима.Детальное исследование кинетики прямой и обратной реакции обеих стадий показало, что в отсутствие РНК-субстрата значение k cat / K m обратной реакции первой стадии (пирофосфолиз лизил- Промежуточное соединение Nζ-5′-фосфогуанозина в лизин и GTP) в 120 раз выше, чем в прямой реакции. Второй этап (перенос GMP-фрагмента с лизил-Nζ-5′-фосфогуанозина на 5′-конец дифосфата) является в значительной степени перспективным, с 10-кратной разницей в k cat / K м значения (96).
Подобно ДНК- и РНК-лигазам, РНК-GTазы обычно состоят из двух доменов — N-концевой GTase, которая содержит консервативный мотив KxDG, и C-концевого домена связывания олигонуклеотидов / олигосахаридов (OB). OB-складки состоят из <200 остатков и участвуют во взаимодействиях оцДНК, оцРНК и белок-белок (97). Белки, содержащие OB-фолд, присутствуют во всех царствах жизни и участвуют в разнообразных, но важных действиях, таких как репликация ДНК, репарация, рекомбинация, транскрипция, реакция холодового шока и поддержание теломер (97–99).
OB-складка состоит из пятицепочечного бета-ствола, покрытого на одном конце альфа-спиралью, расположенной между третьей и четвертой цепями, и представляет собой связывающую щель на другом конце (99). Петли, соединяющие β-цепи, могут различаться по последовательности, длине и конформации и могут вносить вклад в специфичность связывания OB-складок. OB-складки часто присутствуют в белках в виде тандемных повторов, где они могут обеспечивать кооперативное связывание с нуклеиновыми кислотами (99).
Известно, что OB-складчатые домены реконструируют структуру белка, лиганда и во многих случаях совместно свертывают взаимодействующие стороны при связывании лиганда (97).Кристаллические структуры кэппирующих ферментов в свободном, GTP-связанном состоянии и ковалентных GMP-связанных промежуточных продуктов демонстрируют, что значительные перемещения OB-складчатого домена относительно GTase домена связаны с взаимодействием с субстратом и этапами химии (93). В кристаллических структурах GTase PBCV-1 вируса хлореллы асимметричная единица состоит из двух молекул кэпирующего фермента, одна из которых имеет открытую конформацию с узкой, но глубокой щелью между доменами GTase и OB. Другая молекула принимает «закрытую» конформацию, в которой щель закрыта от растворителя из-за жесткого движения домена OB (рис. 4).Только закрытое подтверждение способно связывать кофактор иона металла и образовывать ковалентный промежуточный фермент-GMP (100). Открытые и закрытые конформеры также наблюдались в кристаллических структурах человека и Candida albicans, GTases (9100), оба из которых демонстрируют общую структурную консервативность в кармане связывания гуанина. Как это опосредованное OB-складчатым доменом открытие и закрытие расщелины активного сайта участвует в связывании субстрата, высвобождении продукта и катализе реакции GTase, все еще остается без ответа.
Рисунок 4.
Открытая и закрытая конформации кэпирующего фермента PBCV-1 вируса хлореллы (PDB 1CKM). Фермент кэпирования РНК PBCV-1 принимает двулопастную структуру, в которой N-концевой домен гуанилилтрансферазы и C-концевой складчатый домен OB расположены по обе стороны от белка, а активный сайт расположен на границе раздела двух доменов. Асимметричная единица кристаллической структуры кэпирующего фермента вируса хлореллы содержит две белковые единицы, каждая из которых имеет различную конформацию.В открытом конформере (синий) щель между двумя доменами составляет ∼15 Å в самом широком месте, тогда как в закрытом конформере (оранжевый) щель полностью закрывает один конец для растворителя из-за жесткого движения OB-складки. домен. Интересно, что Lys82, нуклеофил, который формирует связь лизил-Nζ с поступающим GMP (красный и фиолетовый), обнаруживает очень ограниченное движение внутри активного сайта (100).
Рисунок 4.
Открытая и закрытая конформации кэпирующего фермента PBCV-1 вируса хлореллы (PDB 1CKM).Фермент кэпирования РНК PBCV-1 принимает двулопастную структуру, в которой N-концевой домен гуанилилтрансферазы и C-концевой складчатый домен OB расположены по обе стороны от белка, а активный сайт расположен на границе раздела двух доменов. Асимметричная единица кристаллической структуры кэпирующего фермента вируса хлореллы содержит две белковые единицы, каждая из которых имеет различную конформацию. В открытом конформере (синий) щель между двумя доменами составляет ∼15 Å в самом широком месте, тогда как в закрытом конформере (оранжевый) щель полностью закрывает один конец для растворителя из-за жесткого движения OB-складки. домен.Интересно, что Lys82, нуклеофил, который формирует связь лизил-Nζ с поступающим GMP (красный и фиолетовый), обнаруживает очень ограниченное движение внутри активного сайта (100).
РНК-гуанин-N7-метилтрансферазная активность
МТаза гуанин-N7 (EC 2.1.1.56) катализирует перенос метильной группы от S-аденозилметионина (SAM) на GpppRNA с образованием m7GpppRNA и S-аденозилгомоцистеина (SAH) (реакция 3, рис. 2). РНК-гуанин-N7 МТазы классифицируются как фолд-метилтрансфераза Россманна (RFM), поскольку SAM-связывающий домен структурно подобен фолд-метилтрансферазе Россманна (101, 102).
Считается, что перенос метильной группы происходит по классическому механизму S N 2, примером которого являются экзоциклические аминные ДНК-метилтрансферазы. Связанный с серой метилкарбокатион SAM действует как сильный электрофил, тогда как первичный амин в положении N7 гуанозинового кэпа является нуклеофилом. В большинстве охарактеризованных N6 аденозиновых ДНК-МТаз амин N6 дезоксиаденозина неизменно находится в непосредственной близости от основного аминокислотного остатка, который депротонирует азот, поскольку он атакует электрофильный метилкарбокатион (103).Любопытно, что в кристаллических структурах гуанин-N7 MTase Ecm1 паразита микроспоридий Encephalitozoon cuniculi и фермента VP4, улавливающего вирус синего языка, не обнаружено никаких прямых контактов между ферментом и атомом N7 или метильным углеродом SAM. Это привело к постулату, что РНК-гуанин-N7 MTases катализируют путем координации реагирующих сторон в правильном положении вместо стабилизации переходного состояния или активации нуклеофила (104,105).
Как последняя стадия образования кэпа 0, процесс метилирования кэпа регулируется множеством механизмов.Белок c-Myc, который, как известно, играет важную роль в синтезе клеточного белка, пролиферации и трансформации клеток, было показано, что он активирует активность РНК-гуанин-N7-МТазы (RNMT) млекопитающих посредством активации S-аденозил-гомоцистеин-гидролазы (SAHH), которая гидролизует S -аденозил гомоцистеин, побочный продукт ингибирования метилтрансферазной реакции (106,107). Ранее считалось, что RNMT действует как мономер, он взаимодействует с не охарактеризованным белком RAM / Fam103a1. RAM увеличивает аффинность связывания RNMT с РНК, активирует ее активность MTase и привлекает комплекс RNMT-RAM к сайтам инициации транскрипции (108,109).RAM также требуется для поддержания уровней мРНК, трансляции и жизнеспособности клеток (108). Совсем недавно было обнаружено, что процесс метилирования кэпа дополнительно регулируется фосфорилированием RNMT зависимым от клеточного цикла образом. CDK1-циклин B1 фосфорилирует Thr77 RNMT во время фазы G2 / M и ингибирует взаимодействие RNMT с KPNA2, известным ингибитором RNMT. Фосфорилирование RNMT Thr77 приводит к увеличению активности m7G MTase в начале фазы G1, предположительно, чтобы не отставать от всплеска транскрипции мРНК (110).Такой механизм контроля, наряду с упомянутым ранее механизмом контроля качества кэпа, предполагает, что статус метилирования кэпа потенциально является важной точкой регуляции экспрессии генов.
Кеппинг вирусной РНК
Учитывая множественные важные роли кэп-структуры в трансляции белка и врожденном иммунитете, вирусы эволюционировали, чтобы производить кэпированную РНК для эффективного синтеза белка и уклонения от врожденного иммунного ответа со стороны клетки-хозяина.Поскольку большая часть клеточного кэппинга РНК происходит в ядре, вирусы, которые реплицируются в цитоплазме, генерируют свои собственные кэпы РНК. Это достигается за счет кодирования их собственных механизмов кэппирования РНК или кражи кэпа у мРНК хозяина (отрывание кэпа).
Оборудование для укупорки вирусной РНК
Какими бы разнообразными ни были вирусы, механизм кэппирования вирусной РНК далек от монолита (Таблица 1). Вирус хлореллы (дцДНК) обладает активностями GTase и TPase, расположенными в разных белках.Вирус осповакцины (dsDNA) и вирус синего языка (dsRNA) кодируют многофункциональные белки, которые генерируют cap 0 и cap 1 РНК, соответственно. Флавивирусы ((+) оцРНК), такие как вирус Денге и вирус Западного Нила, и парамиксовирусы ((-) оцРНК) связывают активности GTase и MTase с их РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRp).
Alphavirus ((+) ssRNA), такой как вирус чикунгунья, изменил порядок этапов фермента для кэппирования РНК. GTP сначала модифицируется и ковалентно связывается с GTase как m7GMP (111), которая затем переносится на обработанную ppRNA с образованием m7G-cap (112) (Таблица 1).Активность альфавируса GTase локализована на nsP1, который также содержит активности MTase гуанин-N7. Активность РНК-ТПазы находится в nsP2, который является частью РНК-зависимого комплекса РНК-полимеразы и протеазы, которая преобразует вирусный полипротеин P1234 в отдельные неструктурные белки. Механизм кэппирования в Alphavirus связан с вирусной активностью RdRp, локализованной в nsP4, посредством белок-белковых взаимодействий (113,114).
Рабдовирус ((-) оцРНК) использует уникальный механизм кэппирования РНК.Вместо GTase, которая образует ковалентный интермедиат фермент-GMP, вирус везикулярного стоматита кодирует полирибонуклеотидилтрансферазу RNA: GDP (PRNTase), которая образует ковалентную связь с 5′-концом вирусной РНК через монофосфатную группу. Затем фермент переносит 5′-монофосфатную РНК на GDP, образуя структуру GpppRNA, которая в дальнейшем модифицируется до m7G cap 0 и 2’O метилированного cap 1 (Таблица 1). Наиболее интересно то, что 2’O MTase имеет тот же сайт связывания SAM с гуанин-N7 MTase и не требует метилирования N7 для метилирования 2’O.Активность метилирования и активность PRNTase кодируются в L-белке, который также содержит вирусную активность RdRp (115–118).
Флавивирусы кодируют одну МТазу, которая последовательно катализирует метилирование амина N7 гуанозинового кэпа и 2’O нуклеозида +1 (119). Доказательства подтверждают модель, согласно которой МТаза вируса Западного Нила модифицирует GpppA-РНК на m7GpppA-РНК, которая затем диссоциирует и повторно связывается с другой молекулой МТазы в GTP-связывающем кармане для метилирования 2’O (120).
Многофункциональные укупорочные ферменты
Некоторые ферменты кэпинга вирусов объединяют все необходимые ферментативные активности кэппинга РНК для создания кэпа 0 или кэпа 1 в одном полипептиде. Фермент, блокирующий вирус осповакцины, и фермент, блокирующий вирус блютанга, являются двумя примерами, чьи полноразмерные белковые структуры были решены (рис. 5).
Вирус осповакцины, прототип вируса семейства поксвирусов, кодирует гетеродимерный фермент, улавливающий РНК, состоящий из большой субъединицы D1 и малой субъединицы D12.Хотя все три активности фермента, необходимые для генерации кэпа 0, расположены в D1, активность гуанин-N7 MTase требует ассоциации с D12 для эффективного функционирования (121–123). Структурные и биохимические данные свидетельствуют о том, что взаимодействие D12 с гуанин-N7 МТазным доменом вызывает конформационные изменения, необходимые для эффективного катализа (124). Структура фермента, улавливающего коровью осповакцины, показывает, что три активности фермента аккуратно организованы в виде дискретных модулей в порядке TPase, GTase и guanine-N7 MTase от N- до C-конца (рис. 5A).Домен TPase содержит элегантную 8-ми нитевую β-бочкообразную структуру, характерную для металлозимов трифосфатного туннеля (TTM). Присутствие GTP и SAH однозначно идентифицирует активные сайты GTase и MTase. Структура также предполагает, что субъединица D12 представляет собой дисфункциональную 2’O МТазу, которая стала избыточной, поскольку вирус приобрел отдельную 2’O МТазу VP39 (124,125).
Рисунок 5.
Многофункциональные ферменты, укрывающие РНК. ( A ) Структура укупорочного фермента осповакцины совместно кристаллизовалась с GTP и SAH (PDB 4CKB).Фермент состоит из двух субъединиц D1 и D12. Функциональные домены упорядочены как TPase (синий), GTase (оранжевый) и гуанин-N7 MTase (бежевый) от N- до C-конца в D1. Субъединица D12 окрашена в зеленый цвет. Обратите внимание на β-бочкообразную характеристику металлоферментов трифосфатного туннеля (ТТМ). Как обозначено молекулой SAH (пурпурный), активный сайт гуанин-N7 MTase открывается назад, от активного сайта GTase, как показано молекулой GTP (красный). ( B ) Структура VP4 кэпирующего фермента вируса синего языка.Показана кристаллическая форма, содержащая две молекулы гуанина (красный) и две молекулы SAH (пурпурный) (PDB 2JHP). Функциональные домены расположены от N- до C-конца в порядке киназоподобного (KL) домена (розовый), 2’O МТазного домена (зеленый), гуанин-N7 МТазы и предполагаемого комбинированного домена TPase / GTase (оранжевый ). МТазный домен гуанин-N7 состоит из двух прерывистых последовательностей, окрашенных в светло-коричневый и бежевый цвета. В структуре отсутствуют два участка полипептида из 10 и 13 аминокислотных остатков в С-концевом домене TPase / GTase.Молекулы SAH (пурпурный) четко идентифицируют активные центры гуанин-N7 МТазы и 2’O МТазы в структуре. Предполагаемый каталитический остаток TPase Cys518 окрашен в ярко-зеленый цвет.
Рис. 5.
Многофункциональные ферменты, укрывающие РНК. ( A ) Структура укупорочного фермента осповакцины совместно кристаллизовалась с GTP и SAH (PDB 4CKB). Фермент состоит из двух субъединиц D1 и D12. Функциональные домены упорядочены как TPase (синий), GTase (оранжевый) и гуанин-N7 MTase (бежевый) от N- до C-конца в D1.Субъединица D12 окрашена в зеленый цвет. Обратите внимание на β-бочкообразную характеристику металлоферментов трифосфатного туннеля (ТТМ). Как обозначено молекулой SAH (пурпурный), активный сайт гуанин-N7 MTase открывается назад, от активного сайта GTase, как показано молекулой GTP (красный). ( B ) Структура VP4 кэпирующего фермента вируса синего языка. Показана кристаллическая форма, содержащая две молекулы гуанина (красный) и две молекулы SAH (пурпурный) (PDB 2JHP). Функциональные домены расположены от N- до C-конца в порядке киназоподобного (KL) домена (розовый), 2’O МТазного домена (зеленый), гуанин-N7 МТазы и предполагаемого комбинированного домена TPase / GTase (оранжевый ).МТазный домен гуанин-N7 состоит из двух прерывистых последовательностей, окрашенных в светло-коричневый и бежевый цвета. В структуре отсутствуют два участка полипептида из 10 и 13 аминокислотных остатков в С-концевом домене TPase / GTase. Молекулы SAH (пурпурный) четко идентифицируют активные центры гуанин-N7 МТазы и 2’O МТазы в структуре. Предполагаемый каталитический остаток TPase Cys518 окрашен в ярко-зеленый цвет.
Фермент, кэпирующий вирус синего языка VP4, объединяет все 4 ферментативные активности для создания структуры cap 1 (126–128).Кристаллические структуры VP4 были решены в присутствии суррогатов субстрата, а именно гуанинового основания, GpppG и SAH (105). Белок принимает удлиненную форму с N-концевым и C-концевым доменами, ответственными за гомодимеризацию, которая необходима для сборки VP4 в вирусную сердцевидную частицу (129). МТаза гуанин-N7 и 2’O МТаза хорошо консервативны с другими известными структурами, но домены РНК-ТРазы и GTase не могут быть однозначно идентифицированы. Биохимические исследования обнаружили лизин, ответственный за промежуточный лизил-фосфогуанозин, вблизи С-конца белка (105).Однако в структурах VP4 нельзя обнаружить консервативную укладку GTase. Наиболее интересно то, что структура VP4 не содержит туннельной структуры β-бочонка, характерной для РНК-ТПазной активности вирусных и простейших кэпирующих ферментов. Вместо этого предполагаемый мотив HCXXXXXR (S / T) цистеинфосфатазы, характерный для кэпирующего аппарата многоклеточных животных, локализован совместно с предполагаемым активным сайтом GTase в щели рядом с С-концом белка (105).
Несмотря на то, что эти кристаллические структуры дали ответы на многие вопросы, возникают более интересные вопросы.Например, структура фермента, укрывающего коровью осповакцины, показывает, что активный сайт гуанин-N7 МТазы, связанный с SAH, расположен на задней стороне щели, где расположены активные сайты РНК-ТРазы и GTase (125). Фермент претерпевает резкие конформационные изменения или олигомеризуется, чтобы эффективно осуществлять активность гуанин-N7 МТазы на только что кэпированной РНК? Действительно ли у кэпирующего фермента вируса блютанга новый комбинированный домен GTase и TPase, содержащий фосфатазу цистеиновой РНК? Чтобы пролить свет на эти загадки, потребуются дополнительные биохимические доказательства и структуры, связанные с РНК.
Кепка отрывная
Вместо механизма улавливания некоторые РНК-вирусы крадут «кэп» у РНК-хозяина в процессе, называемом «отрыванием кэпа». В вирусе гриппа ((-) ssRNA) РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) представляет собой комплекс из трех белков: основного белка полимеразы 1 (PB1), основного белка полимеразы 2 (PB2) и кислотного белка полимеразы (PA) (130, 131 ). После сборки в ядре (132) субъединица PB2 связывается с кэп-структурой РНК, кэпированной хозяином. Эндонуклеазная активность PA затем расщепляет первые 10-15 нуклеотидов кэпированной РНК, которые затем используются для примирования транскрипции вирусной мРНК (133-136) (Таблица 1).Отрывание кепки было впервые продемонстрировано с использованием мРНК глобина человека (134, 135, 137), и с тех пор предполагалось, что он предпочитает мРНК и пре-мРНК в качестве мишеней для захвата. Это предположение было недавно опровергнуто исследованием, которое фокусируется на кепированной РНК вместо поли (А) РНК. Исследование показало, что вирус гриппа A предпочитает некодирующие мяРНК U1 и U2 мРНК или пре-мРНК для захвата (138). Интересно, что значительная часть захваченных последовательностей происходит из менее изученной малой РНК, ассоциированной с промотором (PASR), которая, как недавно было показано, блокируется механизмом кэпирования цитоплазмы (28) (см. Cytoplasmic RNA (re) -cappping выше).До сих пор не ясно, на какой стадии созревания snRNA происходит отрыв кэпа, и не имеет ли отсечение 5′-кэпированных последовательностей из этих регуляторных PASR какие-либо последствия для клеток-хозяев или вирусной репликации (138), но результаты, вероятно, будут играть важную роль. важную роль в понимании взаимодействий вирус-хозяин на уровне регуляторной РНК.
Тотивирусы L-A и L-BC (дцРНК) S. cerevisiae используют более прямой подход к отрыванию крышки. Вирусный белок Gag отщепляет группу m7GMP от РНК хозяина и образует ковалентный интермедиат гистидил-m7GMP.Группа m7GMP затем транскрипционно переносится на 5′-дифосфат вирусных транскриптов (139–141) (Таблица 1). Сходство процесса захвата с канонической активностью GTase предполагает эволюционную связь между захватом крышки у тивируса и механизмом улавливания эукариот (142, 143).
Применение ферментов кэпирования РНК
Ферменты кэппинга создают структуру кэпа 0 на РНК, несущую 5′-концевую трифосфатную или дифосфатную группу. Как обсуждалось в предыдущих разделах, структура cap 0 необходима для эффективной трансляции мРНК in vivo .Кепирующий фермент осповакцины и 2’O МТаза были использованы для создания структур cap 0 и cap 1 на in vitro транскриптах , которые затем можно использовать для трансфекции эукариотических клеток и управления синтезом белка (подробнее см. В Exogenous mRNA technologies ). Способность генерировать cap 0 и cap 1 РНК in vitro также оказалась неоценимой при исследовании роли G cap и его 2’O-метилирования в врожденном иммунитете (2,68,76,81). Новые разработки в области флуоресцентно-меченого GTP, совместимого с аппаратом трансляции, позволили синтезировать флуоресцентно-меченую РНК in vitro (144).Использование GTP, конъюгированного с дестиобиотином, для in vitro кэппирования РНК позволило обогатить бактериальные транскрипты для глубокого секвенирования (145) (подробнее см. В Cappable-Seq RNA секвенировании ).
Экзогенные технологии мРНК
В качестве матрицы для синтеза белка введение мРНК в клетки является наиболее интуитивным способом управления экспрессией целевых белков в клетке. Хотя о трансфекции РНК в клетки сообщалось в 1990-х годах, экспрессия генов, управляемая РНК, не была подробно изучена в основном из-за неопределенности в стабильности, эффективности и иммуногенности экзогенной РНК.Благодаря лучшему пониманию биологической роли модификаций оснований и рибозы, путей клеточной деградации, в сочетании с технологическими достижениями в ферментативном синтезе и модификации РНК и клеточных средств доставки, введение экзогенной мРНК стало жизнеспособным вариантом для управления экспрессией белка in situ (146). Репрограммирование стволовых клеток (147–149), вакцинация (150–156) и экспрессия терапевтических белков (157–161) — это лишь некоторые из постоянно растущих примеров технологий экзогенных мРНК (146, 157).
В качестве средства стимулирования экспрессии целевого белка in situ введение РНК дает ряд преимуществ по сравнению с ДНК. Во-первых, нет опасений по поводу непреднамеренной интеграции материала РНК в геном, как в случае с векторами на основе ДНК. Во-вторых, хотя ДНК-векторам необходимо войти в ядро, чтобы транскрибироваться в мРНК, которая затем экспортируется в цитоплазму для трансляции, прямая доставка мРНК в цитоплазму обходит эти препятствия. Кроме того, было показано, что кинетика экспрессии белка после введения РНК достигает пика и затухает в течение нескольких дней, гораздо быстрее, чем при ДНК-управляемой экспрессии белка, которая проявляет медленное затухание в течение недель (155), что делает РНК лучшим вариантом для приложений. например, вакцинация, когда желательна временная экспрессия.Использование мРНК также позволяет одновременно экспрессировать несколько белков in situ . Как и в случае с ДНК-векторами, режимы терапии или вакцинации на основе мРНК выигрывают от возможности быстрого производства и доставки, что может иметь решающее значение в ответ на вспышки заболеваний.
Ферментативный синтез функциональной мРНК
Чтобы избежать переноса материала животного или вирусного происхождения, желательно производить терапевтические РНК ферментативно, используя материалы, не содержащие животных in vitro .Как правило, ДНК-зависимая РНК-полимераза транскрибирует матрицу ДНК, содержащую соответствующий промотор, в транскрипт РНК. Поли (А) хвост может быть получен котранскрипционно путем включения поли (Т) тракта в матричную ДНК или отдельно с использованием поли (А) полимеразы. Транскрипт может быть кэпирован котранскрипционно с использованием кэп-аналога или отдельно с использованием кэпирующего фермента. Копирование ко-транскрипции с использованием аналога кэпа имеет то преимущество, что является простым рабочим процессом. Однако одним из недостатков этого подхода является теоретическая эффективность кэппинга <100% из-за конкуренции со стороны GTP за исходный нуклеотид.
Ферментное кэппирование, обычно выполняемое с использованием кэпирующего фермента осповакцины, позволяет полностью кэппировать РНК, генерируя кэп 0 РНК. В приложениях, где необходимо минимизировать врожденный иммунный ответ, структура cap 0 может быть дополнительно модифицирована в cap 1 с использованием специфичной для cap 2’O-метилтрансферазы. Было показано, что использование m5CTP и псевдоуридинтрифосфата вместо CTP и UTP соответственно при транскрипции снижает индуцированный TLR иммунный ответ и ингибирование синтеза белка (161–163).С другой стороны, индукция низкого уровня врожденного ответа с использованием немодифицированных РНК или кэпов РНК без 2’O-метилирования может быть полезной в таких применениях, как вакцинация.
мРНК вакцины
Вакцинация посредством введения мРНК имеет много положительных качеств по сравнению с традиционными живыми аттенуированными целыми организмами. МРНК вакцины не только не индуцирует противовекторный иммунитет, но и является недолговечным и часто самоограничивающимся источником продукции in situ антигена.Он может регулироваться и регулироваться функцией РНК и экспрессией генов. Производство простое и может быстро отреагировать, как только станет известна последовательность генома возбудителя болезни (164). В отличие от ДНК-вакцин, время реакции производства антигена быстрее и эффективнее, поскольку мРНК-вакцины могут транслироваться непосредственно в цитозоле. Также не стоит беспокоиться о возможной интеграции генома (164).
мРНК Вакцинация показала многообещающие результаты при вирусной инфекции гриппа (165 166), аллергии (167 168) и регрессии опухоли на животных моделях (169 170). In situ g задокументированы внедрение опухолеспецифических белков-антигенов, быстрая индукция Т и активация естественных клеток-киллеров, инфильтрация иммунных клеток в опухолевую массу (170). Вакцины с мРНК, нацеленные на рак простаты и рак легких, вступили в фазу II и фазу I клинических испытаний в США, соответственно (171) (идентификаторы на Clinicaltrials.gov: NCT01817738, NCT01
4).мРНК-вакцинация может осуществляться двумя способами: путем введения мРНК-вакцины пациентам или путем трансфекции аутологичных дендритных клеток с помощью мРНК-вакцины и повторного введения активированных дендритных клеток пациенту (154).МРНК может доставляться вирусными векторами или синтетическими носителями. Недавние достижения в разработке синтетических носителей позволили эффективную доставку вакцины с мРНК (151 153 156 159), что позволило избежать использования вирусных векторов и риска заражения материалами животного происхождения во время производства. МРНК может быть синтезирована ферментативно in vitro или продуцирована in situ с использованием самоамплифицирующейся мРНК.
Самоусиливающаяся мРНК
Используя преимущества аппарата альфавируса, блокирующего транскрипцию РНК, была разработана технология самоамплификации мРНК в качестве носителя экспрессии гена in situ для вакцинации.Альфавирус имеет (+) геном оцРНК, кодирующий неструктурный пре-белок nsp1-4 для РНК-зависимой репликации, транскрипции и кэпирования РНК, а также два капсидных белка E2 и E1. Было показано, что путем замены генов капсидных белков интересующим геном кэпированные и полиаденилированные самоамплифицирующиеся конструкции РНК более эффективны в индукции иммунного ответа, чем вакцинация с помощью стандартной мРНК (172), и эффективны на моделях животных (150, 153, 166, 173). Для более подробного ознакомления с текущим состоянием исследований, доклинических испытаний и производства мРНК и самоусиливающейся мРНК мы отсылаем читателя к следующим отчетам (150, 174).
Секвенирование РНК Cappable-Seq
Ферменткэпинга осповакцины способен кэпировать РНК с помощью 3′-модифицированного GTP (145). Новая методология, основанная на этой способности, была разработана для обогащения и секвенирования видов 5′-трифосфатной РНК из биологических образцов (145). Называемый Cappable-seq фермент, улавливающий коровью коровью, используется для блокирования 5′-трифосфатных или дифосфатных концов РНК из биологического образца с использованием 3′-дестхиобиотина GTP. Затем виды дестиобиотинилированной кэпированной РНК могут быть обогащены и глубоко секвенированы.Cappable-seq достиг 50-кратного обогащения первичных транскриптов и идентифицировал ранее не сообщаемые сайты начала транскрипции (TSS) по всему геному при разрешении одного основания в Escherichia coli (145). Этот метод также применялся для идентификации транскриптома микробиома из образцов слепой кишки мышей и впервые идентифицировал TSS в микробиоме. Поскольку рибосомные РНК процессируются и не имеют кэпируемых 5′-концов, Cappable-seq также истощает рРНК, которая в противном случае должна быть истощена другими способами (175).Таким образом, Cappable-seq эффективно снижает сложность транскриптома и стоимость секвенирования. Помимо продуцирования молекул мРНК in vitro , ферменты, кэпирующие РНК, потенциально могут быть универсальным реагентом, модифицирующим 5′-РНК, полезность которого только начинает оцениваться.
ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Хотя кэп-структуры мРНК были открыты в 1970-х, их биологические роли стали более глубоко изучены только в результате недавних работ.В дополнение к его роли в экспорте мРНК, созревании мРНК и синтезе белка, новое понимание роли кэпа РНК в врожденном иммунитете помогло продвинуться в области синтетических мРНК и их in vivo, и терапевтических применений. Врожденная иммунная система оказывает сильное селективное давление на РНК без 5′-кэпа, так что вирусы изобрели и заново изобрели самые разные стратегии для ограничения своей РНК. Исследования этих вирусных систем выявили удивительно разнообразные средства и молекулярные механизмы для генерации кэпированной РНК.Это также привело к появлению таких приложений, как эффективные системы кэппирования РНК in vitro и и технология самоусиливающейся мРНК, облегчая крупномасштабное производство функциональной мРНК для in vitro и терапевтическое применение. Новое применение ферментов, улавливающих РНК, также позволило секвенировать и количественно оценить транскриптомы микробиома.
По мере того, как мы узнаем больше, мы, как всегда, будем задавать новые вопросы. Кеппинг РНК включает три ферментативные реакции на 5′-конце транскрипта.Как 5′-конец РНК переносится или репозиционируется между тремя активными сайтами? Пройдет ли комплекс ферментов обширное ремоделирование или он образует олигомер более высокого порядка? С другой стороны, открытие механизма цитоплазматического (повторного) укупоривания является захватывающим и вызывает новые интересные вопросы. Например, в дополнение к 5′-сайтам CAGE, внутренние сайты CAGE и связанные с промотором малые РНК (PASR) составляют значительную часть мишени цитоплазматического кепирования. В каких процессах участвуют эти повторно кэпированные РНК? Каково взаимодействие между цитоплазматическим (повторным) кэппированием и хранением и деградацией РНК П-тел? Является ли предпочтительное отрывание кэпа от мяРНК и PASR вирусом гриппа A эволюционной тактикой для выживания и репликации вируса?
Возможно, более удивительно то, что кэп РНК более распространен и разнообразен, чем кэп m7G.Помимо 2,2,7-триметилгуанозинового кэпа (176, 177), 5′-γ-метилфосфатного кэпа (178) и диметилмонофосфатного кэпа (179), недавний отчет о новых и не охарактеризованных кэпах в клетках млекопитающих требует дальнейшего изучения. исследование идентичности и функций этих новых крышек (180). Открытие NAD- и кофермента A-cap РНК в бактериях и идентификация NAD-блокированных малых регуляторных РНК в E. coli разрушает парадигму эксклюзивности RNA cap у эукариот (181–183).Каковы роли крышек NAD и CoA? Присутствуют ли они также у архей и эукариот? Это лишь некоторые из интересных вопросов, на которые нужно ответить.
Мы благодарим Рича Робертса, Билла Джека и Ларри Макрейнольдса за критическое прочтение рукописи.
ФИНАНСИРОВАНИЕ
New England Biolabs Inc. Финансирование платы за открытый доступ: New England Biolabs Inc.
Заявление о конфликте интересов . Дж. Б. Робб и С. Чан в настоящее время являются сотрудниками New England Biolabs, которая занимается продажей реагентов для молекулярной биологии.
ССЫЛКИ
1.и другие.
2′-O метилирование кэпа вирусной мРНК позволяет избежать ограничения хозяина членами семейства IFIT
Природа
2010
468
452
456
2.Структурная основа распознавания m7G и дискриминации 2′-O-метила в кэпированных РНК рецептором врожденного иммунитета RIG-I
Proc. Natl.Акад. Sci. США
2016
113
596
601
3.Цитоплазматический кэпирующий комплекс собирается на адапторном белке Nck1, связанном с богатым пролином С-концом кэпирующего фермента млекопитающих
PLoS Biol.
2014
12
e1001933
4.Энзимология синтеза кэпа РНК
Wiley Interdiscip. Ред. РНК
2010
1
152
172
5.Традиционные и нетрадиционные механизмы кепирования вирусной мРНК
Нац.Rev. Microbiol.
2012
10
51
65
6.Конец дела: кэппинг и полиаденилирование
Нац. Struct. Биол.
2000
7
838
842
7.Функциональное соединение кэппинга и транскрипции мРНК
Мол. Ячейка
2002
10
599
609
8.Молекулярная основа транскрипционно-связанного кэппинга пре-мРНК
Мол.Ячейка
2015
58
1079
1089
9.Структура гуанилилтрансферазного домена мРНК-кэпирующего фермента человека
Proc. Natl. Акад. Sci. США
2011
108
10104
10108
10.Кепирующий фермент млекопитающих дополняет мутант Saccharomyces cerevisiae без мРНК гуанилилтрансферазы и избирательно связывает удлиненную форму РНК-полимеразы II
Proc.Natl. Акад. Sci. США
1997
94
12898
12903
11.Характеристика человека, Schizosaccharomyces pombe и Candida albicans мРНК кэп-метилтрансферазы и полная замена дрожжевого укупорочного аппарата ферментами млекопитающих
J. Biol. Chem.
1999
274
16553
16562
12.Характеристика hMTr1, 2′-O-рибоза метилтрансферазы человека Cap1
Дж.Биол. Chem.
2010
285
33037
33044
13.2′-O-рибоза метилирование cap2 у человека: функция и эволюция в горизонтально мобильной семье
Nucleic Acids Res.
2011
39
4756
4768
14.Ферменты 5′-кэппинга нацелены на пре-мРНК путем связывания с фосфорилированным карбокси-концевым доменом РНК-полимеразы II
Genes Dev.
1997
11
3306
3318
15.Фермент кэпирования мРНКрекрутируется в комплекс транскрипции путем фосфорилирования карбоксиконцевого домена РНК-полимеразы II
Genes Dev.
1997
11
3319
3326
16.Структурные сведения о том, как укупоривающий фермент млекопитающих считывает код CTD
Мол. Ячейка
2011
43
299
310
17.Регуляция метилирования кэпа мРНК
Biochem. J.
2010
425
295
302
18.Структура Saccharomyces cerevisiae Устройство для кэпирования мРНК Cet1-Ceg1
Структура
2010
18
216
227
19.Как фермент кэпирования мРНК считывает отдельные коды фосфорилирования РНК-полимеразы II и Spt5 CTD
Genes Dev.
2014
28
1323
1336
20.Человеческий Dcp2: каталитически активный фермент декапирования мРНК, расположенный в определенных цитоплазматических структурах
EMBO J.
2002
21
6915
6924
21.Движение мРНК эукариот между полисомами и тельцами цитоплазматического процессинга
Наука
2005
310
486
489
22.Полисомы, Р-тельца и стрессовые гранулы: состояния и судьбы мРНК эукариот
Curr. Opin. Cell Biol.
2009
21
403
408
23.Гомеостаз шапки не зависит от длины поли (А) хвоста
Nucleic Acids Res.
2016
44
304
314
24.Переназначение сообщения
Trends Biochem. Sci.
2009
34
435
442
25.Идентификация цитоплазматического комплекса, который добавляет кэп к 5′-монофосфатной РНК
Мол. Клетка. Биол.
2009
29
2155
2167
26.и другие.
Анализ экспрессии генов Cap-анализа для высокопроизводительного анализа начальной точки транскрипции и идентификации использования промотора
Proc. Natl. Акад. Sci. США
2003
100
15776
15781
27.Неограниченные 5′-концы мРНК, нацеленные на карту цитоплазматического кэппинга, в окрестности нижележащих тегов CAGE
FEBS Lett.
2015
589
279
284
28.и другие.
Посттранскрипционный процессинг генерирует разнообразие 5′-модифицированных длинных и коротких РНК
Природа
2009
457
1028
1032
29.Путь декапирования и рекапирования матричной РНК у трипаносомы
Proc. Natl. Акад. Sci. США
2015
112
6967
6972
30.Идентификация мишеней цитоплазматического кепирования показывает роль гомеостаза кэпа в трансляции и стабильности мРНК
Cell Rep.
2012
2
674
684
31.Механизм контроля качества 5′-концевого кэпирования пре-мРНК млекопитающих и неожиданная связь кэпинга с процессингом пре-мРНК
Мол. Ячейка
2013
50
104
115
32.Идентификация механизма контроля качества для кэппирования 5′-конца мРНК
Природа
2010
467
608
611
33.Структура и функция 5 ‘-> 3’ экзорибонуклеазы Rat1 и ее активирующего партнера Rai1
Природа
2009
458
784
788
34.Dxo1 — новый тип эукариотического фермента, обладающий как декапирующей, так и 5′-3′-экзорибонуклеазной активностью
Нац. Struct. Мол. Биол.
2012
19
1011
1017
35.Распознавание структуры кэпа при сплайсинге in vitro предшественников мРНК
Ячейка
1984
38
731
736
36.Предпочтительное удаление 5′-проксимального интрона из предшественников мРНК с двумя интронами, опосредованное кэп-структурой
Proc.Natl. Акад. Sci. США
1987
84
5187
5191
37.Влияние структуры кэпа на сплайсинг пре-мРНК в ядрах ооцитов Xenopus
Genes Dev.
1989
3
1472
1479
38.Условные мутанты дрожжевого фермента, укрывающего мРНК, показывают, что кэп усиливает, но не требуется для сплайсинга мРНК
РНК
1996
2
584
596
39.Cap и cap-связывающие белки в контроле экспрессии генов
Wiley Interdiscip. Ред. РНК
2011
2
277
298
40.Gonatopoulos-Pournatzis
T.
Cap-связывающий комплекс (CBC)
Biochem. J.
2014
457
231
242
41.Процессинг и экспорт РНК
Колд Спринг Харб. Перспектива. Биол.
2010
2
a000752
42.Комплекс, связывающий ядерный кэп, взаимодействует с три-snRNP U4 / U6 · U5 и способствует сборке сплайсосом в клетках млекопитающих
РНК
2013
19
1054
1063
43.Участие комплекса связывания ядерного кэпа в 3′-процессинге пре-мРНК
Proc. Natl. Акад. Sci. США
1997
94
11893
11898
44.и другие.
Человеческий кеп-связывающий комплекс функционально связан с экзосомой ядерной РНК
Нац. Struct. Мол. Биол.
2013
20
1367
1376
45.Транспорт макромолекул между ядром и цитоплазмой
РНК
1998
4
351
364
46.Сборка и транспортировка переднего пассажира RNP
Proc.Natl. Акад. Sci. США
2001
98
7012
7017
47.Взаимодействие между кэп-связывающим комплексом и фактором экспорта РНК необходимо для безинтронного экспорта мРНК
J. Biol. Chem.
2007
282
15645
15651
48.Механизм экспорта мРНК человека задействован на 5′-конце мРНК
Ячейка
2006
127
1389
1400
49.Ядерный экспорт мРНК: краткий обзор
J. Cell Sci.
2009
122
1933
1937
50.Ядерный экспорт мРНК: от места транскрипции в цитоплазму
Exp. Cell Res.
2004
296
12
20
51.Дрожжевой ядерный кэп-связывающий комплекс может взаимодействовать с фактором трансляции eIF4G и опосредовать инициацию трансляции
Мол. Ячейка
2000
6
191
196
52.Комплекс инициации трансляции pioneer функционально отличается от комплекса инициации трансляции в стационарном состоянии, но структурно перекрывается с ним
Genes Dev.
2004
18
745
754
53.Биосенсор РНК для визуализации первого раунда трансляции от единичных клеток к живым животным
Наука
2015
347
1367
1671
54.eIF4AIII усиливает трансляцию мРНК, связанных с ядерным кеп-связывающим комплексом, способствуя разрушению вторичных структур в 5’UTR
Proc.Natl. Акад. Sci. США
2014
111
E4577
E4586
55.CBP80-промотированные реаранжировки мРНП во время первого раунда трансляции, нонсенс-опосредованный распад мРНК и после этого
Колд Спринг Харб. Symp. Quant. Биол.
2010
75
127
134
56.Инициация трансляции мРНК, связанных с ядерным кэп-связывающим белковым комплексом CBP80 / 20, требует взаимодействия между CBP80 / 20-зависимым фактором инициации трансляции и эукариотическим фактором инициации трансляции 3g
Дж.Биол. Chem.
2012
287
18500
18509
57.Первый этап перевода: особенности и функции
Ячейка
2010
142
368
374
58.Визуализация молекулярной социологии на ядерной периферии клетки HeLa
Наука
2016
351
969
972
59.Двойная функция кэп-структуры матричной РНК в трансляции, стимулированной поли (A) -хвостом у дрожжей
Природа
1998
392
516
520
60.Трансляция, стимулированная поли (A) -хвостом в дрожжах: значение для контроля трансляции
РНК
1998
4
1321
1331
61.От факторов к механизмам: трансляция и контроль трансляции у эукариот
Curr. Opin. Genet. Dev.
1999
9
515
521
62.Поли (A) -связывающие белки необходимы для различных биологических процессов у многоклеточных животных
Biochem.Soc. Пер.
2014
42
1229
1237
63.Влияние 5′-концевой кэп-структуры на инициацию трансляции мРНК вируса коровьей оспы
J. Biol. Chem.
1978
253
1710
1715
64.Метилирование Cap рибозы мРНК c-mos стимулирует трансляцию и созревание ооцитов у Xenopus laevis
Nucleic Acids Res.
1998
26
3208
3214
65.и другие.
Различная передача сигналов RIG-I и MDA5 вирусами РНК при врожденном иммунитете
J. Virol.
2008
82
335
345
66.RIG-I формирует сигнально-компетентные филаменты АТФ-зависимым, убиквитин-независимым образом
Мол. Ячейка
2013
51
573
583
67.Молекулярный механизм восприятия и интеграции сигнала сенсором врожденного иммунитета, индуцируемый ретиноевой кислотой ген-I (RIG-I)
Дж.Биол. Chem.
2011
286
27278
27287
68.и другие.
2′-O-метилирование рибозы обеспечивает молекулярную сигнатуру для различения собственной и чужой мРНК, зависящей от сенсора РНК Mda5
Нац. Иммунол.
2011
12
137
143
69.Датчик врожденного иммунитета LGP2 активирует противовирусную передачу сигналов, регулируя взаимодействие MDA5-РНК и сборку филаментов
Мол.Ячейка
2014
55
771
781
70.Кинетический механизм дискриминации длины вирусной дцРНК филаментами MDA5
Proc. Natl. Акад. Sci. США
2012
109
E3340
E3349
71.Структурная модель активации RIG-I
РНК
2012
18
2118
2127
72.и другие.
Структурные и функциональные сведения о распознавании паттернов РНК 5′-ppp рецептором врожденного иммунитета RIG-I
Нац. Struct. Мол. Биол.
2010
17
781
787
73.Структурные основы распознавания и активации РНК рецептором врожденного иммунитета RIG-I
Природа
2011
479
423
427
74.Автоингибиторный интерфейс CARD2-Hel2i RIG-I управляет выбором РНК
Nucleic Acids Res.
2016
44
896
909
75.и другие.
Противовирусный иммунитет через RIG-I-опосредованное распознавание РНК, несущей 5′-дифосфаты
Природа
2014
514
372
375
76.и другие.
Консервативный гистидин в датчике РНК RIG-I контролирует иммунную толерантность к N1-2’O-метилированной собственной РНК
Иммунитет
2015
43
41
51
77.и другие.
IFIT1 — противовирусный белок, распознающий 5′-трифосфатную РНК
Нац. Иммунол.
2011
12
624
630
78.Структурная основа распознавания вирусной 5′-PPP-РНК белками IFIT человека
Природа
2013
494
60
64
79.Врожденное иммунное ограничение и антагонизм вирусной РНК, лишенной 2′-O метилирования
Вирусология
2015
479-480
66
74
80.IFIT1: двойная сенсорная и эффекторная молекула, которая обнаруживает не-2′-O метилированную вирусную РНК и ингибирует ее трансляцию
Фактор роста цитокинов Ред.
2014
25
543
550
81.Ингибирование трансляции членами семейства IFIT определяется их способностью избирательно взаимодействовать с 5′-концевыми областями cap0-, cap1- и 5’ppp- мРНК
Nucleic Acids Res.
2014
42
3228
3245
82.Мастер-сенсоры патогенных РНК — РИГ-I-подобные рецепторы
Иммунобиология
2013
218
1322
1335
83.Структура и механизм РНК-трифосфатазного компонента мРНК-кэпирующего фермента млекопитающих
EMBO J.
2001
20
2575
2586
84.Структурно-функциональный анализ туннеля активного центра дрожжевой РНК трифосфатазы
J. Biol. Chem.
2001
276
17261
17266
85.РНК-трифосфатаза вируса хлореллы. Мутационный анализ и механизм ингибирования триполифосфатом
J. Biol. Chem.
2002
277
15317
15324
86.Структурная основа каталитического механизма 25-кДа тиаминтрифосфатазы млекопитающих
J. Biol. Chem.
2008
283
10939
10948
87.и другие.
Структурные детерминанты специфичности и каталитического механизма у млекопитающих 25 кДа тиаминтрифосфатазы
Биохим. Биофиз. Acta
2013
1830
4513
4523
88.Полифосфатазная активность CthTTM, бактериального трифосфатного туннельного металлофермента
J. Biol. Chem.
2008
283
31047
31057
89.Кристаллическая структура и биохимический анализ показывают, что металлофермент AtTTM3 туннельного трифосфатного туннеля Arabidopsis является триполифосфатазой, участвующей в развитии корней
Завод Дж.
2013
76
615
626
90.и другие.
Специфическая неорганическая трифосфатаза из Nitrosomonas europaea : структура и каталитический механизм
J. Biol. Chem.
2011
286
34023
34035
91.Структурные детерминанты связывания субстрата и катализа в металлоферментах трифосфатного туннеля
Дж.Биол. Chem.
2015
290
23348
23360
92.Структура и механизм дрожжевой РНК трифосфатазы: важный компонент аппарата кэппинга мРНК
Ячейка
1999
99
533
543
93.Суперсемейство полинуклеотидлигазы и РНК-кэпирующего фермента ковалентных нуклеотидилтрансфераз
Curr. Opin. Struct. Биол.
2004
14
757
764
94.Ковалентный катализ в реакциях переноса нуклеотидов: основные мотивы в Saccharomyces cerevisiae РНК-кэпирующий фермент консервативен в Schizosaccharomyces pombe и вирусных кэпирующих ферментах, а также среди полинуклеотидных лигаз
Proc. Natl. Акад. Sci. США
1994
91
12046
12050
95.Механизм кэпирования мРНК гуанилилтрансферазой вируса коровьей оспы: характеристика промежуточного фермента-гуанилата
Proc.Natl. Акад. Sci. США
1981
78
187
191
96.Кинетическая и термодинамическая характеристика реакции гуанилилтрансферазы РНК
Биохимия
2008
47
3863
3874
97.Распознавание нуклеиновых кислот OB-фолд-белками
Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.
2003
32
115
133
98.OB-складчатые домены: моментальный снимок эволюции последовательности, структуры и функции
Curr.Opin. Struct. Биол.
2002
12
794
801
99.Олигонуклеотид / олигосахарид-связывающие складчатые белки: растущее семейство хранителей генома
Crit. Rev. Biochem. Мол. Биол.
2010
45
266
275
100.Рентгеновская кристаллография выявляет большие конформационные изменения во время переноса гуанила ферментами, укрывающими мРНК
Ячейка
1997
89
545
553
101.Множество путей к метилтрансферу: хроника конвергенции
Trends Biochem. Sci.
2003
28
329
335
102.РНК-метилтрансферазы, участвующие в биосинтезе 5′-кэпа
RNA Biol.
2014
11
1597
1607
103.Структура, функция и механизм экзоциклических ДНК-метилтрансфераз
Biochem. J.
2006
399
177
190
104.Структура и механизм мРНК кэп (гуанин-N7) метилтрансферазы
Мол. Ячейка
2004
13
77
89
105.Вирус синего языка VP4 представляет собой конвейерную линию для улавливания РНК
Нац. Struct. Мол. Биол.
2007
14
449
451
106.Gonatopoulos-Pournatzis
T.
S-аденозилгомоцистеингидролаза необходима для Myc-индуцированного метилирования кэпа мРНК, синтеза белка и пролиферации клеток
Мол.Клетка. Биол.
2009
29
6182
6191
107.Специфическая регуляция метилирования кэпа мРНК факторами транскрипции c-Myc и E2F1
Онкоген
2009
28
1169
1175
108.Gonatopoulos-Pournatzis
T.
RAM / Fam103a1 требуется для метилирования кэпа мРНК
Мол. Ячейка
2011
44
585
596
109.N-концевой некаталитический домен кэп-метилтрансферазы человека (RNMT) опосредует рекрутирование на сайты инициации транскрипции
Biochem. J.
2013
455
67
73
110.CDK1-Cyclin B1 активирует RNMT, координируя метилирование кэпа мРНК с транскрипцией фазы G1
Мол. Ячейка
2016
61
734
746
111.Реакция кэпирования мРНК альфавируса: образование ковалентного комплекса неструктурного белка nsP1 с 7-метил-GMP
Proc.Natl. Акад. Sci. США
1995
92
507
511
112.Идентификация новой функции укупорочного аппарата альфавирусов. РНК 5′-трифосфатазная активность Nsp2
J. Biol. Chem.
2000
275
17281
17287
113.Супрессорные мутации, которые позволяют РНК-полимеразе вируса sindbis функционировать с неароматическими аминокислотами на N-конце: доказательства взаимодействия между nsP1 и nsP4 в синтезе минус-цепи РНК
Вирусология
2000
276
148
160
114.Модификация Asn374 nsP1 подавляет мутант минус-цепочечной полимеразы nsP4 вируса Синдбис
J. Virol.
2002
76
8641
8649
115.Уникальная стратегия метилирования кэпа мРНК, используемая вирусом везикулярного стоматита
Proc. Natl. Акад. Sci. США
2006
103
8493
8498
116.Нетрадиционный механизм кэпирования мРНК РНК-зависимой РНК-полимеразой вируса везикулярного стоматита
Мол.Ячейка
2007
25
85
97
117.Опосредованный гистидином перенос РНК в GDP для уникального кэпирования мРНК РНК-полимеразой вируса везикулярного стоматита
Proc. Natl. Акад. Sci. США
2010
107
3463
3468
118.In vitro кэппирование и транскрипция рабдовирусов
Методы
2013
59
188
198
119.Отдельные элементы РНК придают специфичность событиям метилирования кэпа РНК флавивируса
J. Virol.
2007
81
4412
4421
120.Метилтрансфераза вируса Западного Нила катализирует два метилирования вирусного кэпа РНК посредством механизма репозиции субстрата
J. Virol.
2008
82
4295
4307
121.Домен мРНК (гуанин-7-) метилтрансферазы фермента, укрывающего мРНК вируса осповакцины.Экспрессия в Escherichia coli и структурное и кинетическое сравнение с интактным кэппирующим ферментом
J. Biol. Chem.
1994
269
14974
14981
122.Внутренняя РНК (гуанин-7) метилтрансферазная активность субъединицы D1 кэпирующего фермента вируса осповакцины стимулируется субъединицей D12. Идентификация аминокислотных остатков в белке D1, необходимых для ассоциации субъединиц и переноса метильной группы
Дж.Биол. Chem.
1994
269
24472
24479
123.Генетический анализ мРНК кэп-метилтрансферазы поксвируса: Подавление условных мутаций в стимулирующей субъединице D12 мутациями второго сайта в каталитической субъединице D1
Вирусология
2006
352
145
156
124.Структурные представления о механизме и эволюции мРНК вируса осповакцины кэп N7 метилтрансферазы
EMBO J.
2007
26
4913
4925
125.Кристаллическая структура фермента, улавливающего мРНК вируса коровьей оспы, дает представление о механизме и эволюции укупорочного устройства
Структура
2014
22
452
465
126.Экспрессированный белок VP4 вируса блютанга связывает GTP и является кандидатом гуанилилтрансферазы вируса
Вирусология
1992
189
757
761
127.Активность гуанилилтрансферазы и РНК-5′-трифосфатазы очищенного экспрессированного белка VP4 вируса блютанга
J. Mol. Биол.
1998
280
859
866
128.Кэппирование и метилирование мРНК очищенным рекомбинантным белком VP4 вируса блютанга
Proc. Natl. Акад. Sci. США
1998
95
13537
13542
129.Домен, подобный лейциновой молнии, необходим для димеризации и инкапсидации нуклеокапсидного белка вируса блютанга VP4
Дж.Virol.
1998
72
2983
2990
130.Структурное понимание существенного контакта субъединиц PB1-PB2 РНК-полимеразы вируса гриппа
EMBO J.
2009
28
1803
1811
131.и другие.
Структурные представления о захвате кепки и синтезе РНК полимеразой гриппа
Природа
2014
516
361
366
132.Ядерный импорт и сборка РНК-полимеразы вируса гриппа А, изученные в живых клетках с помощью флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии
J. Virol.
2010
84
1254
1264
133.Эндонуклеаза полимеразы вируса гриппа, захватывающая кепку, находится в субъединице PA
Природа
2009
458
914
918
134.Перенос 5′-концевой кэпа мРНК глобина на комплементарную РНК вируса гриппа во время транскрипции in vitro
Proc.Natl. Акад. Sci. США
1979
76
1618
1622
135.Уникальная кэп (m7GpppXm) -зависимая эндонуклеаза вириона гриппа расщепляет кэпированные РНК с образованием праймеров, которые инициируют транскрипцию вирусной РНК
Ячейка
1981
23
847
858
136.На пути к пониманию атомарного разрешения механизма репликации вируса гриппа
Curr. Opin. Struct. Биол.
2010
20
104
113
137.Синтезируются ли 5′-концы мРНК вируса гриппа? in vivo? — донорские мРНК хозяина?
Ячейка
1979
18
329
334
138.Вирус гриппа А преимущественно захватывает некодирующие крышки РНК
РНК
2015
21
2067
2075
139.Снятие кэпа дрожжевой двухцепочечной РНК L-A Вирус может действовать в транс-трансфере и требует, чтобы вирусная полимераза активно участвовала в транскрипции
Дж.Биол. Chem.
2012
287
12797
12804
140.Механизм захвата колпачка у дрожжевого L-A двухцепочечного РНК вируса
Proc. Natl. Акад. Sci. США
2011
108
17667
17671
141.Снятие колпачка у дрожжей L-BC двухцепочечная РНК тотивирус
J. Biol. Chem.
2013
288
23716
23724
142.Белок оболочки дрожжевого двухцепочечного РНК вируса L-A ковалентно присоединяется к кэп-структуре мРНК эукариот
Мол.Клетка. Биол.
1992
12
3390
3398
143.His-154 участвует в связывании белка Gag вируса Saccharomyces cerevisiae L-A двухцепочечной РНК с кэп-структурой мРНК и необходим для экспрессии сателлитного вируса M1
Мол. Клетка. Биол.
1994
14
2664
2674
144.Эффективное получение и свойства мРНК, содержащих аналог флуоресцентного кэпа: Anthraniloyl-m (7) GpppG
Пер.(Остин, Техас)
2015
3
e988538
145.Новая стратегия обогащения выявляет беспрецедентное количество новых сайтов начала транскрипции при разрешении одного основания в модельном прокариоте и микробиоме кишечника
BMC Genomics
2016
17
199
146.Синтетические мРНК для управления клеточными фенотипами: обзор
N. Biotechnol.
2015
32
229
235
147.Эффективная доставка и функциональная экспрессия трансфицированной модифицированной мРНК в клетках пигментированного эпителия сетчатки, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток
J. Biol. Chem.
2015
290
5661
5672
148.и другие.
Высокоэффективное перепрограммирование до плюрипотентности и направленная дифференцировка клеток человека с синтетической модифицированной мРНК
Стволовая клетка
2010
7
618
630
149.Оптимизированные условия для успешной трансфекции эндотелиальных клеток человека синтезированной in vitro и модифицированной мРНК для индукции экспрессии белка
J. Biol. Англ.
2014
8
8
150.Нуклеиновые кислотные вакцины: перспективы невирусной доставки мРНК-вакцин
Мнение эксперта. Препарат Делив.
2014
11
885
899
151.Кинетика экспрессии модифицированной нуклеозидами мРНК, доставленной мышам в липидных наночастицах различными путями
Дж.Контроль. Выпуск
2015
217
345
351
152.Вакцинация на основе РНК: отправка сильного сообщения
Мол. Ther.
2013
21
506
508
153.и другие.
Катионная наноэмульсия для доставки РНК-вакцин нового поколения
Мол. Ther.
2014
22
2118
2129
154.МРНК: от химической схемы производства белка до готового терапевтического препарата
Hum. Вакцин. Immunother.
2013
9
265
274
155.Спонтанное клеточное поглощение экзогенной матричной РНК in vivo является нуклеиновой кислотой, насыщаемой и ионно-зависимой
Gene Ther.
2007
14
1175
1180
156.Интраназальная вакцинация наночастицами мРНК индуцирует профилактический и терапевтический противоопухолевый иммунитет
Sci.Реп.
2014
4
5128
157.мРНК как генная терапия: как контролировать экспрессию белка
J. Control. Выпуск
2011
150
238
247
158.Доставка невирусных генов в боковые желудочки головного мозга крыс: начальные доказательства широкого распространения и экспрессии в центральной нервной системе
Мол. Ther.
2001
3
375
384
159.Стабильность липоплексов мРНК / катионных липидов в спинномозговой жидкости человека и крысы: методы и доказательства доставки гена невирусной мРНК в центральную нервную систему
Hum. Gene Ther.
2003
14
191
202
160.и другие.
Экспрессия терапевтических белков после доставки химически модифицированной мРНК у мышей
Нац. Biotechnol.
2011
29
154
157
161.Повышение эритропоэза у мышей, которым вводили субмикрограммовые количества псевдоуридин-содержащей мРНК, кодирующей эритропоэтин
Мол. Ther.
2012
20
948
953
162.Подавление распознавания РНК Toll-подобными рецепторами: влияние модификации нуклеозидов и эволюционное происхождение РНК
Иммунитет
2005
23
165
175
163.Включение псевдоуридина в мРНК усиливает трансляцию за счет уменьшения активации PKR
Nucleic Acids Res.
2010
38
5884
5892
164.Введение в вакцины и терапевтические средства на основе РНК
Эксперт Rev. Вакцины
2015
14
151
152
165.и другие.
Защитная эффективность синтезированных in vitro специфических мРНК-вакцин против инфекции вируса гриппа A
Нац.Biotechnol.
2012
30
1210
1216
166.и другие.
Быстро производимая вакцина SAM ® против гриппа H7N9 является иммуногенной для мышей
Emerg. Микробы заражают.
2013
2
e52
167.Профилактическая вакцинация мРНК против аллергии
Curr. Opin. Allergy Clin. Иммунол.
2010
10
567
574
168.Иммунизация и вакцинация мРНК с оптимизированной безопасностью исчезновения с панелью из 29 аллергенов
J. Allergy Clin. Иммунол.
2009
124
e1
e11
169. Вакцины на основе мРНКвзаимодействуют с лучевой терапией для уничтожения установленных опухолей
Radiat. Онкол.
2014
9
180
170.Высокоэффективные противораковые вакцины на основе мРНК представляют собой привлекательную платформу для комбинированной терапии, поддерживающей улучшенный терапевтический эффект
Дж.Gene Med.
2012
14
428
439
171.и другие.
Самоадъювантная вакцинация мРНК у пациентов с распространенным раком простаты: первое исследование фазы I / IIa с участием людей
J. Immunother. рак
2015
3
26
172.Полинуклеотидный вектор мРНК вируса Синдбис обеспечивает пролонгированную и высокую экспрессию гетерологичных генов in vivo
Nucleic Acids Res.
1995
23
1495
1501
173.и другие.
Невирусная доставка самоамплифицирующихся РНК-вакцин
Proc. Natl. Акад. Sci. США
2012
109
14604
14609
174.и другие.
Вакцины с самоусиливающейся мРНК
Adv.Genet.
2015
89
179
233
175.и другие.
Сравнительный анализ методов секвенирования РНК для деградированных образцов или образцов с низким входом
Нац. Методы
2013
10
623
629
176.Важная роль кэпов триметилгуанозиновой РНК в мейозе Saccharomyces cerevisiae и их потребность в сплайсинге мейотических пре-мРНК SAE3 и PCh3
Nucleic Acids Res.
2011
39
5633
5646
177.Мутационный анализ триметилгуанозинсинтазы (Tgs1) и Mud2: белки, участвующие в сплайсинге пре-мРНК
РНК
2010
16
1018
1031
178.Метилтрансфераза Bin3 РНК нацелена на РНК 7SK для контроля транскрипции и трансляции
Wiley Interdiscip. Ред. РНК
2012
3
633
647
179.РНК-метилтрансфераза человека BCDIN3D регулирует процессинг микроРНК
Ячейка
2012
151
278
288
180.Множественность 5′-кэп-структур, присутствующих на коротких РНК
PLoS One
2014
9
e102895
181.Анализ клеточной РНК методом ЖХ / МС выявил РНК, связанную с НАД
Нац. Chem. Биол.
2009
5
879
881
182.Химический скрининг конъюгатов биологических малых молекул и РНК выявляет РНК, связанную с КоА
Proc.Natl. Акад. Sci. США
2009
106
7768
7773
183.NAD captureSeq указывает на NAD как на бактериальный колпачок для подмножества регуляторных РНК
Природа
2015
519
374
377
© Автор (ы) 2016. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.
Кэппирование и метилирование мРНК очищенным рекомбинантным белком VP4 вируса блютанга
Proc Natl Acad Sci U S A.1998 Nov 10; 95 (23): 13537–13542.
Биохимия
, * † , ‡ , ‡ , * и * † § ¶Н. Рамадеви
* Институт исследования окружающей среды вирусологии и микробиологии окружающей среды, Mansfield Road, Oxford OX1 3SR, Соединенное Королевство; † Департамент биохимии Оксфордского университета, Саут-Паркс-Роуд, Оксфорд OX1 3QU, Соединенное Королевство; § Департамент международного здравоохранения, Школа общественного здравоохранения 408-й, Университет Алабамы в Бирмингеме, Университетская станция, Бирмингем, AL 35294; и ‡ Институт здоровья животных, лаборатория Пирбрайта, Эш-роуд, Пирбрайт, Уокинг, графство Суррей, GU24 0NF, Соединенное Королевство
Николас Дж.Берроуз
* Институт вирусологии и микробиологии Совета по исследованиям окружающей среды, Мэнсфилд-роуд, Оксфорд, Оксфорд, 3SR, Соединенное Королевство; † Департамент биохимии Оксфордского университета, Саут-Паркс-Роуд, Оксфорд OX1 3QU, Соединенное Королевство; § Департамент международного здравоохранения, Школа общественного здравоохранения 408-й, Университет Алабамы в Бирмингеме, Университетская станция, Бирмингем, AL 35294; и ‡ Институт здоровья животных, лаборатория Пирбрайта, Эш-роуд, Пирбрайт, Уокинг, графство Суррей, GU24 0NF, Соединенное Королевство
Питер П.К. Мертенс
* Институт вирусологии и микробиологии Совета по исследованиям окружающей среды, Мэнсфилд-роуд, Оксфорд, Оксфорд, 3SR, Соединенное Королевство; † Департамент биохимии Оксфордского университета, Саут-Паркс-Роуд, Оксфорд OX1 3QU, Соединенное Королевство; § Департамент международного здравоохранения, Школа общественного здравоохранения 408-й, Университет Алабамы в Бирмингеме, Университетская станция, Бирмингем, AL 35294; и ‡ Институт здоровья животных, лаборатория Пирбрайта, Эш-роуд, Пирбрайт, Уокинг, графство Суррей, GU24 0NF, Соединенное Королевство
Ян М.Джонс
* Институт вирусологии и микробиологии Совета по исследованиям окружающей среды, Мэнсфилд-роуд, Оксфорд, Оксфорд, 3SR, Соединенное Королевство; † Департамент биохимии Оксфордского университета, Саут-Паркс-Роуд, Оксфорд OX1 3QU, Соединенное Королевство; § Департамент международного здравоохранения, Школа общественного здравоохранения 408-й, Университет Алабамы в Бирмингеме, Университетская станция, Бирмингем, AL 35294; и ‡ Институт здоровья животных, Лаборатория Пирбрайта, Эш-Роуд, Пирбрайт, Уокинг, Суррей GU24 0NF, Соединенное Королевство
Полли Рой
* Совет по исследованию окружающей среды Институт вирусологии и микробиологии окружающей среды, Мэнсфилд-роуд, Оксфорд, Оксфорд. 3SR, Великобритания; † Департамент биохимии Оксфордского университета, Саут-Паркс-Роуд, Оксфорд OX1 3QU, Соединенное Королевство; § Департамент международного здравоохранения, Школа общественного здравоохранения 408-й, Университет Алабамы в Бирмингеме, Университетская станция, Бирмингем, AL 35294; и ‡ Институт здоровья животных, Лаборатория Пирбрайта, Эш-Роуд, Пирбрайт, Уокинг, Суррей GU24 0NF, Соединенное Королевство
* Институт вирусологии и экологической микробиологии Совета по исследованиям окружающей среды, Мэнсфилд-роуд, Оксфорд OX1 3SR, Соединенное Королевство ; † Департамент биохимии Оксфордского университета, Саут-Паркс-Роуд, Оксфорд OX1 3QU, Соединенное Королевство; § Департамент международного здравоохранения, Школа общественного здравоохранения 408-й, Университет Алабамы в Бирмингеме, Университетская станция, Бирмингем, AL 35294; и ‡ Институт здоровья животных, лаборатория Пирбрайта, Эш-роуд, Пирбрайт, Уокинг, графство Суррей, GU24 0NF, Соединенное Королевство
Сообщено Аароном Дж.Шаткин, Центр передовых биотехнологий и медицины, Пискатауэй, штат Нью-Джерси
Получено 1 мая 1998 г .; Принято 19 августа 1998 г.
Copyright © 1998, Национальная академия наук Эта статья цитируется в других статьях в PMC.Abstract
Ядро вируса блютанга (BTV) представляет собой мультиферментный комплекс, состоящий из двух основных белков (VP7 и VP3) и трех второстепенных белков (VP1, VP4 и VP6) в дополнение к вирусному геному. Ядро является транскрипционно активным и продуцирует кэпированную мРНК, с которой транслируются все белки BTV, но относительная роль каждого компонента ядра в общем процессе реакции остается неясной.Ранее мы показали, что белок VP4 массой 76 кДа обладает гуанилилтрансферазной активностью, необходимой частью реакции кэпирования РНК. Здесь, благодаря использованию высокоочищенного (> 95%) VP4 и синтетических сердцевидных частиц, содержащих VP4, мы исследовали степень, в которой этот белок также отвечает за другие активности, связанные с образованием шапки. Мы показываем, что VP4 катализирует превращение неметилированного GpppG или in vitro -продуцируемых некэпированных транскриптов РНК BTV в m 7 GpppGm в присутствии S -аденозил-1-метионина.Анализ метилированных продуктов реакции с помощью ВЭЖХ выявил активности метилтрансферазы 1 и 2 типа, связанные с VP4, демонстрируя, что полная реакция кэппирования BTV связана с этим одним белком.
МРНК эукариот как клеточного, так и вирусного происхождения обладают двумя примечательными и отличительными особенностями: полиаденилирование 3′-конца и гуанилирование / метилирование (кэп-структура) на 5′-конце. Наличие метилированной кэп-структуры, например, m 7 G (5 ‘) ppp (5′) NpNpNp, на крайнем 5′-конце эукариотической мРНК является важным компонентом для эффективной инициации трансляции и стабильности многих мРНК. (см. обзоры в исх.1–3). Он также защищает мРНК от деградации 5’-экзонуклеазой (4). Кепка обычно синтезируется в ядре клетки, и, соответственно, вирусы, реплицирующиеся в цитоплазме инфицированных клеток, кодируют собственные ферменты для кепирования мРНК (1, 3, 5). Кепирование мРНК было изучено в нескольких вирусных системах (6–12). Из исследований вирусных и клеточных ферментных систем (13-15) были предложены следующие последовательные реакции для образования кэпа: стадия 1: pppGpN1pN2 → ppGN1pN2 + p; шаг 2: GTP + фермент → фермент-GMP + Pp; шаг 3: фермент-GMP + ppGN1pN2 → GpppGpN1 pN2….+ фермент; шаг 4: GpppGpN1pN2…. + AdoMet → m 7 GpppGpN1pN2…. . + AdoHcy; шаг 5: m 7 GpppGpN1pN2…. + AdoMet → m 7 GpppGmpN1pN2…. . + AdoHcy, где pN — любой рибонуклеотид, p — неорганический фосфат, Pp — неорганический пирофосфат, m 7 G — 7-метилгуанозин, Gm — 2′-метилгуанозин, AdoMet — S -аденозил-1-метионин и AdoHcy представляет собой S -аденозил-1-гомоцистеин.
Процесс состоит из ряда отдельных реакций, которые катализируются различной активностью ферментов.На этапе 1 активность РНК-трифосфатазы удаляет 5′-концевой фосфатный остаток из формирующейся РНК. На этапе 2 фермент гуанилилтрансфераза, ответственный за гуанилирование, ковалентно связывает GMP под действием нуклеотидной фосфогидролазы. На этапе 3 этот комплекс фермент-GMP переносит GMP на дифосфат на 5′-конце субстратной РНК и, как следствие, GMP закрывает РНК через 5′-5′-трифосфатную связь. На стадии 4 структура кэпа метилируется путем переноса метильной группы от AdoMet в положение 7 концевого гуанозина, в результате чего образуется структура кэпа 0 и высвобождается AdoHcy.Часто (стадия 5) фермент метилтрансфераза может также переносить метильную группу с субстрата AdoMet на 2′-гидроксильную группу рибозы первого (N1) или первого и второго (N1 и N2) нуклеотидов, образуя тип 1 и конструкции кепки 2-го типа соответственно (16, 17).
Вирусы семейства Reoviridae, такие как реовирус и вирус блютанга (BTV), содержат геномы двухцепочечных сегментированных РНК, в которых как «плюс» смысловые РНК, так и внутриклеточные виды мРНК закрыты.BTV имеет семь структурных белков (VP1 – VP7), организованных в два слоя капсида. Внутренний капсид, или «ядро», содержит пять белков (VP1, VP3, VP4, VP6 и VP7). Ядра являются транскрипционно активными, производя кэпированные и метилированные полноразмерные копии мРНК для каждого из 10 геномных сегментов (18). Как и многие эукариотические вирусные и клеточные мРНК, мРНК BTV обладают структурой cap 1 (18). Считается, что VP1 является РНК-полимеразой, а VP6 — РНК-геликазой (19, 20). Ранее мы показали, что коровый белок VP4 обладает гуанилилтрансферазной активностью (21).Неизвестно, участвует ли VP4 в других аспектах процесса укупорки. In vitro VP4 связывает рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды и проявляет активность NTPase (22). Однако связывание ингибируется присутствием донора метила (AdoMet), что позволяет предположить, что VP4 может обладать метилтрансферазной активностью (18).
Здесь, используя VP4 либо как очищенный рекомбинантный белок, либо собранный в рекомбинантные сердцевинные частицы (CLP; ссылка 23), мы показали, что VP4 катализирует две активности метилтрансферазы.VP4 переносит метильную группу от AdoMet в положение 7 кэпирующего остатка гуанозина на 5′-конце аналогов РНК, но он также катализирует метилирование рибозы предпоследнего 5′-концевого нуклеотида. Обсуждается значение ассоциации этих активностей с одним вирусным белком.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вирусы и клетки.
Клетки Spodoptera frugiperda (Sf9) выращивали в среде TC100 (GIBCO / BRL) с добавлением 10% (об. / Об.) Фетальной телячьей сыворотки.Клетки выращивали в виде суспензионных или однослойных культур при 28 ° C. Рекомбинантные вирусы ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV), экспрессирующие либо VP4 серотипа 10 BTV (AcBTV10.4), либо VP3 (AcBTV10.3), либо VP7 (AcBTV 10.7), размножали в суспензионной культуре, как описано (23).
Очистка белков.
BTV-рекомбинантный белок VP4 и CLP, содержащие VP3, VP7 и VP4, были очищены из рекомбинантных AcNPV-инфицированных клеток Sf9, как описано (23, 24). Присутствие белков BTV в полученных CLP было подтверждено после их очистки центрифугированием в градиенте скорости сахарозы, SDS / PAGE и вестерн-блоттингом с использованием поликлональных антител BTV10.
Анализ метилтрансферазы.
Перенос метила от Ado [ метил — 3 H] Met к коммерчески доступному GpppG и m 7 GpppG, используемому в качестве акцепторных молекул, измеряли следующим образом. Стандартная реакционная смесь содержала 200 мкМ GpppG или 200 мкМ m 7 GpppG, 50 мМ Tris⋅HCl (pH 7,5), 9 мМ MgCl 2 , 2 мкМ Ado [ метил — 3 H] Met (87 Ки / ммоль), 6 мМ DTT и 15 мкг очищенного VP4 или 30 мкг очищенных CLP с (или без) VP4 в 100 мкл.После инкубации при 30 ° C в течение 2 часов реакционные смеси обрабатывали 2 мкг протеиназы K. Смесь инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут, и протеиназу K инактивировали нагреванием путем инкубации при 70 ° C в течение 10 минут. мин. После экстракции фенолом продукты осаждали 9 об. Холодного этанола; 10 мкл 100 мМ GTP использовали в качестве носителя для осаждения.
Получение
in vitro транскриптов , содержащих 5′-концевые трифосфаты.РНК-транскриптов, представляющих точные копии сегмента 5 BTV, были получены посредством in vitro транскрипции плазмиды pEc-10B 5 -Hδ ДНК, которая содержит полноразмерную копию кДНК сегмента 5 BTV, клонированную в pUC119 и фланкированную промотор Т7 выше по течению и рибозим гепатита δ ниже по течению.Транскрипцию Т7 проводили с использованием набора для крупномасштабной транскрипции RiboMAX (Promega) в условиях, указанных поставщиком, со следующими модификациями: каждая реакция транскрипции содержала поставляемый буфер, 4 мМ каждого NTP, 1-2 мкг ДНК и 2 мкл поставляемую ферментную смесь в конечном объеме 20 мкл. Реакции инкубировали при 37 ° C в течение 3 часов. Добавляли две единицы ДНКазы, не содержащей РНКаз, и инкубацию продолжали в течение 15 мин при 37 ° C. После экстракции фенолом / хлороформом РНК пропускали через спин-колонку G25 (Pharmacia) для удаления невключенных NTP и количественно определяли спектрофотометрией.
Анализы гуанилилтрансферазы с использованием [α-
32 P] GTP.Стандартные реакционные смеси (100 мкл) содержали 50 мМ Tris⋅HCl (pH 7,5), 9 мМ MgCl 2 , 6 мМ DTT, 10 мкМ AdoMet, 6 мкМ [α- 32 P] GTP (400 Ки / ммоль), 0,5–1,5 A 260 единиц РНК-транскриптов BTV M5 в качестве акцептора и 15 мкг очищенного VP4 или 30 мкг очищенных CLP с или без VP4. После инкубации при 30 ° C в течение 2 часов РНК экстрагировали, как описано выше, и расщепляли 10 мкг нуклеазы P1 в 15 мкл 20 мМ ацетата натрия (pH 5.5) в течение 60 мин при 37 ° С.
Разделение и идентификация нуклеотидных продуктов с помощью ВЭЖХ.
Очищенные продукты реакций кэпирования анализировали с помощью ВЭЖХ на Beckman BioSys 510 с использованием ионообменной колонки SAX 5 (Phenomenex, Belmont, CA). Продукты связывались с колонкой в 4 мМ калий-фосфатном буфере (pH 5,5) и элюировались солевым градиентом 0,04–0,5 М того же буфера при скорости потока 1 мл / мин. Колонка была предварительно откалибрована с использованием немеченых метилированных и неметилированных нуклеотидов m 7 GpppG и m 7 GpppGm, а также m 7 GTP, m 7 GDP, m 7 GMP, GTP, GDP и GMP ( Sigma) при тех же условиях.Элюанты собирали и подсчитывали для определения распределения радиоактивности. Результаты наносили на график в зависимости от времени, и идентичность пиков с радиоактивной меткой устанавливали путем сравнения с немечеными маркерами, полученными в идентичных условиях.
Обработка кэп-структур пирофосфатазой.
Аликвоту продукта кэп-структуры, синтезированного in vitro с помощью VP4, инкубировали с 10 единицами кислой пирофосфатазы табака (ТАП) в 100 мкл буфера, поставляемого производителем (Epicenter Technologies, Мэдисон, Висконсин).Затем расщепленный продукт осаждали 10 объемами холодного этанола в присутствии немеченого носителя GTP и анализировали с помощью ВЭЖХ, как описано выше.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Белок VP4 обладает гуанин-7-метилтрансферазной активностью.
Некоторые вирусы обладают гуанилилтрансферазной и метилтрансферазной активностями, кодируемыми одним вирусным белком (25). В нашем предыдущем отчете мы показали, что как геномная двухцепочечная РНК, так и мРНК, синтезируемая ядрами вируса in vitro , имеют 5′-концевую кэп-структуру (m 7 GpppGm) (18).Недавно мы зарегистрировали активность гуанилилтрансферазы, связанную с коровым белком BTV VP4 (26). Поскольку гуанилирование мРНК обычно сопровождается метилированием, возможно, что VP4 также может обладать метилтрансферазной активностью. Чтобы изучить эту возможность, очищенный растворимый VP4 был использован в тесте in vitro , чтобы выяснить, катализирует ли он перенос донорной метильной группы Ado [ метил — 3 H] Met на неметилированный аналог кэпа (GpppG) . Продукты реакции фракционировали с помощью ионообменной хроматографии, и наличие метки определяли по радиоактивности, связанной с каждой фракцией.30-минутная реакция привела к соэлюции большей части метки с m 7 GpppG (рис. A ), тогда как реакции, в которых VP4 нагревали до 68 ° C в течение 15 минут перед добавлением, имели радиоактивность, связанную исключительно с Ado [ метил — 3 H] Мет маркер (фиг. B ). Никаких других радиоактивных пиков в продуктах не было идентифицировано, что согласуется с активностью кэп-метилтрансферазы, связанной с очищенным VP4. Для подтверждения того, что синтезированный продукт действительно представлял собой m 7 GpppG, аликвоту фракции m 7 GpppG расщепляли TAP, и дефосфорилированные продукты затем анализировали с помощью ВЭЖХ в аналогичных условиях.Были идентифицированы два пика: один соответствует положению маркера m 7 G, а другой — m 7 GMP (рис. C ).
Анализ метилированных кэп-структур, синтезированных рекомбинантным VP4. Реакционные смеси (100 мкл) содержат 50 мМ трис-HCl (pH 7,9), 9 мМ MgCl 2 , 6 мМ DTT, 200 мкМ GpppG, 2 мкМАдо [ метил — 3 H] Met (87 Ки / ммоль) и 15 мкг очищенного рекомбинантного VP4. Параллельные реакции проводили с белком VP4, который перед добавлением нагревали до 68 ° C в течение 15 мин.После инкубации в течение двух часов при 30 ° C и обработки протеиназой K реакционную смесь экстрагировали фенолом / хлороформом и осаждали этанолом. Образцы анализировали с помощью ВЭЖХ на системе Beckman BioSys 510 с использованием ионообменной колонки SAX 5. Продукты, выделенные с помощью ВЭЖХ, сушили и считали на сцинтилляционном счетчике, и наносили на график радиоактивность, связанную с каждой фракцией. Указаны позиции некорпоративных AdoMet (SAM) и m 7 GpppG. ( A ) Продукты реакции из смесей, содержащих VP4 в качестве фермента.( B ) Продукты реакции из смесей, содержащих VP4, которые нагревали до 68 ° C в течение 15 минут перед добавлением в реакционную смесь. ( C ) Повторный анализ фракции пика из A после обработки TAP. Уменьшение масштаба отражает тот факт, что было проанализировано только ≈10% пика от A .
VP4 обладает активностью как метилтрансферазы 1, так и 2.
Когда VP4 экспрессируется с помощью структурных белков ядра BTV VP7 и VP3, он инкапсидируется в CLP (23).Таким образом, CLP, содержащие или не содержащие VP4, очищали и анализировали на трансферазную активность. При анализе с помощью ВЭЖХ продукты реакционных смесей, содержащих CLP + VP4, давали три пика (рис. A ), тогда как продукты CLP без VP4 содержали только донор метила [ 3 H-CH 3 ] -AdoMet пик (рис. B ). Путем сравнения с нуклеотидами-маркерами было установлено, что второй пик на фиг. A соответствует m 7 GpppGm (метилирование 2′-положения гуанозин-рибозы) с меньшим пиком в положении m 7 GpppG (рис. А ). Эти данные предполагают, что VP4 обладает активностью как 2′- O -метилирования, так и 5′-кэпа метилирования.
Анализ активности метилтрансферазы VP4 в CLP. Реакции проводили, как описано для фиг. 1, за исключением того, что CLP, содержащие VP4, использовали в качестве фермента вместо VP4. Параллельные реакции проводили только с CLP в качестве контроля. Продукты анализировали с помощью ВЭЖХ и наносили на график, как описано. Указаны позиции некорпоративных AdoMet, m 7 GpppGm и m 7 GpppG.( A ) CLP + VP4. ( B ) Только CLP.
Чтобы подтвердить способность CLP + VP4 катализировать активность гуанозин 2′- O -метилтрансферазы, в качестве альтернативного субстрата в реакции, аналогичной описанной, был предоставлен немеченый аналог метилированного кэпа (m 7 GpppG). выше. Продукты этой реакции дали только два помеченных пика, соответствующих m 7 GpppGm и не включенному [ 3 H-CH 3 ] -AdoMet (рис. А ). CLP без VP4 не производили m 7 GpppGm (рис. B ). Чтобы определить, достаточно ли одного VP4 для реакции, очищенный белок VP4 инкубировали с m 7 GpppG и [ 3 H-CH 3 ] -AdoMet, и продукты реакции анализировали аналогичным образом. Как и в случае реакции CLP + VP4, были идентифицированы два пика (фиг. C ), хотя уровень продуцирования m 7 GpppGm был намного ниже по сравнению с реакциями, в которых VP4 присутствовал в CLP.Был сделан вывод, что VP4 отвечает как за 7-метилтрансферазную, так и за 2- O -метилтрансферазную активности (реакции метилтрансферазы 1 и 2), связанные с ядрами BTV (18).
Идентификация метилтрансферазы типа 2 активности VP4 в составе CLP. Тридцать микрограммов либо CLP + VP4, либо только CLP, либо 15 мкг очищенного VP4 инкубировали с 200 мкМ немеченой метилированной кэп-структуры (m 7 GpppG) и 2 мкМ Ado [ метил — 3 H] Met (87 Ки / ммоль) в присутствии 50 мМ трис-HCl (pH 7.9), 9 мМ MgCl 2 и 6 мМ DTT. После инкубации в течение 2 часов при 30 ° C образцы обрабатывали 10 мкг нуклеазы P1 в течение 60 минут при 37 ° C. Продукты реакции экстрагировали фенолом / хлороформом и осаждали этанолом перед анализом с помощью ВЭЖХ, как описано. Указаны позиции некорпоративных AdoMet и m 7 GpppGm. ( A ) CLP + VP4. ( B ) Только CLP. ( C ) Очищенный VP4. Обратите внимание, что относительные молярные концентрации VP4 в реакциях A и C сильно различаются и указывают на низкую относительную эффективность чистого белка.
GTP и AdoMet образуют кэпированные нуклеотиды в присутствии VP4.
Для дальнейшего определения процесса кэппирования, опосредованного VP4, очищенный белок инкубировали с GTP, GDP или GMP в присутствии Ado [ метил — 3 H] Met, и продукты анализировали с помощью ВЭЖХ. При использовании GDP или GMP был обнаружен только один пик, соответствующий неинкорпорированному Ado [ метил — 3 H] Met (не показан). Напротив, продукты из реакционных смесей, содержащих GTP и AdoMet, давали два основных пика, один из которых соответствовал AdoMet, а другой — m 7 GpppG (рис. А ). Незначительный пик наблюдался перед продуктами m 7 GpppG, которые совместно элюировались с маркером для m 7 GpppGm, хотя подтверждение его идентичности было невозможно из-за небольшого количества извлеченного материала.
Акцепторный нуклеотид для активности метилтрансферазы VP4. ( A ) Рекомбинантный VP4 инкубировали с холодным GTP в присутствии 2 мкМ Ado [ метил — 3 H] Met (87 Ки / ммоль), 50 мМ Tris⋅HCl (pH 7,9), 9 мМ MgCl. 2 и 6 мМ DTT.После инкубации в течение 2 часов при 30 ° C и обработки протеиназой K продукты реакции экстрагировали фенолом / хлороформом и осаждали этанолом. Образцы анализировали с помощью ВЭЖХ. Указаны позиции некорпоративных AdoMet и m 7 GpppG. ( B ) Очищенные CLP, инкапсидирующие VP4 (30 мкг), инкубировали с 6 мкМ ([α- 32 P] GTP (400 Ки / ммоль) и 2 мкМ AdoMet в 50 мМ Tris⋅HCl (pH 7,9), 9 мМ MgCl 2 и 6 мМ DTT. Образцы анализировали, как описано.Указывается положение м 7 GpppGm.
Способность CLP + VP4 использовать GTP в качестве акцептора оценивали путем инкубации с [α- 32 P] GTP и AdoMet. Продукты реакции давали основной радиоактивный пик, соответствующий m 7 GpppGm (фиг. B ). Результаты этого и предыдущих экспериментов предполагают, что метилирование рибозы значительно усиливается, когда VP4 присутствует в CLP. Из-за низкого уровня радиоактивности небольшие пики, показанные на рис. B далее не характеризовали, хотя пики элюирования во фракциях 19-21 и 25-27, скорее всего, представляют продукты m 7 GpppG и GpppG, соответственно.
VP4 в присутствии AdoMet модифицирует мРНК
de Novo BTV с образованием полностью метилированной кэп-структуры.Чтобы исследовать, может ли очищенный рекомбинантный VP4 метилировать мРНК BTV, транскрипт сегмента 5 BTV был получен из кДНК с использованием полимеразы T7, очищенной от невключенных нуклеотидов, и использован в качестве кэп-структуры и акцептора метилирования в присутствии GTP и VP4.Полученные продукты РНК выделяли, и кэп-структуры высвобождали с 5′-конца путем переваривания нуклеазой P1 для восстановления GpppG из неметилированной кэпированной мРНК, m 7 GpppG из кэп 0 мРНК и m 7 GpppGm из кэпа 1 или кэп 2 мРНК. Когда транскрипты, продуцируемые T7, инкубировали с очищенным VP4 и [α- 32 P] GTP в отсутствие AdoMet, 32 P-меченные продукты выделялись в положении маркера GpppG (фиг. A ). , что указывает на то, что транскрипты мРНК являются субстратами для гуанилилирования с помощью VP4.Перенос радиоактивности на транскрипты сегмента 5 также подтверждали электрофорезом в полиакриламидном геле (фиг. D ). Более низкий уровень мечения РНК, наблюдаемый с CLP + VP4 по сравнению с очищенным VP4 (фиг. D ), несмотря на предыдущие указания на то, что инкапсидированный VP4 более эффективен, несомненно, отражает лучший доступ мРНК к неинкапсидированному ферменту. Когда были проанализированы устойчивые к нуклеазе P1 продукты реакционных смесей, которые также содержали AdoMet, два основных пика, меченных 32 P, были выделены в положениях m 7 GpppGm и GpppG с дополнительным второстепенным пиком m. 7 GpppG (рис. Б ). Для подтверждения этих данных реакции были повторены с немеченым GTP и Ado [ метил — 3 H] Met. Главный пик, содержащий тритиевую метку, был восстановлен в положении m 7 GpppGm с второстепенным пиком при m 7 GpppG (фиг. C ). Эти данные предполагают, что активность образования полного кэпа 1 может быть индуцирована предоставлением аутентичного субстрата (мРНК) очищенному VP4.
Модификация 5′-конца мРНК BTV с помощью VP4. Очищенный рекомбинантный VP4 (15 мкг) инкубировали с in vitro -транскрибируемой РНК сегмента 5 в присутствии 6 мкМ [α- 32 P] GTP (400 Ки / ммоль) в 50 мМ Tris-HCl (pH 7 .9), 9 мМ MgCl 2 и 6 мМ DTT в присутствии или в отсутствие 2 мкМ AdoMet. После инкубации при 30 ° C в течение 2 часов РНК в реакционной смеси очищали осаждением и обессоливали путем пропускания через спин-колонку G-25. Образцы анализировали на 4% акриламидных гелях, содержащих 8 М мочевину, или аликвоты расщепляли 10 мкг нуклеазы P1 в течение 1 часа при 37 ° C. Продукты, экстрагированные фенолом / хлороформом и осажденные этанолом, анализировали с помощью ВЭЖХ. Показаны положения GpppG, m 7 GpppG и m 7 GpppGm.( A ) VP4 при отсутствии AdoMet. ( B ) VP4 в присутствии AdoMet. ( C ) VP4 в присутствии немеченого GTP и Ado [ метил — 3 H] Met. ( D ) Авторадиография 4% акриламидного геля, содержащего 8 М мочевины, после электрофореза. Дорожки 1 и 4, только CLP; дорожки 2 и 5 — очищенный VP4; дорожки 3 и 6, CLP + VP4. На дорожках 1–3 реакции содержали только GTP и РНК, тогда как на дорожках 4–6 также присутствовал AdoMet.
ОБСУЖДЕНИЕ
Белки клеточной метилтрансферазы обычно, по-видимому, кодируют только одну активность (13), тогда как ряд вирусных метилтрансфераз, например, кодируемых вирусом осповакцины, обладают дополнительной ферментативной активностью, такой как гуанилилтрансфераза (25, 27).Белки nsP1 вируса леса Семлики и вируса Синдбис (оба вируса с положительной цепью РНК) также кодируют активность как метилтрансферазы, так и гуанилилтрансферазы (28, 29). В вирусе осповакцины РНК-трифосфатаза, РНК-гуанилилтрансфераза и РНК-гуанин-7-метилтрансфераза являются компонентами комплекса кэпирующего фермента, содержащего две субъединицы 95 и 31 кДа (30). Однако активность РНК 2- O -метилтрансферазы опосредуется дополнительным белком VP39 (31). В отличие от этих вирусов, BTV максимизирует свою кодирующую способность за счет того, что минорный коровый белок, VP4, катализирует все необходимые стадии кэппирования и метилирования, т.е.е. активность РНК-трифосфатазы, РНК-гуанилилтрансферазы, РНК-гуанин-7-метилтрансферазы и РНК 2- O -метилтрансферазы.
Когда GpppG инкубировали с очищенным VP4 и Ado [ метил — 3 H] Met, большая часть радиоактивности передавалась GpppG, давая m 7 GpppG, тем самым демонстрируя, что VP4 отвечает за активность метилтрансферазы. Когда m 7 GpppG использовали в качестве субстрата, завершенная структура кэпа (т.е. m 7 GpppGm) также обнаруживалась в реакции.Напротив, полностью модифицированная 5′-концевая структура была основным меченым продуктом, когда GpppG инкубировали с VP4, инкапсидированным в CLP. Представленные данные, вместе с нашей неспособностью обнаружить какой-либо GpppGm в продуктах реакции, указывают на то, что реакции метилтрансферазы, участвующие в образовании кэпа 1 типа, являются последовательными. Перенос метила на 7-гуанин, по-видимому, происходит первым, обеспечивая субстрат m 7 GpppG… для второй реакции метилтрансферазы и образование m 7 GpppGm.Вторая активность метилирования оказалась ограниченной, когда VP4 использовался отдельно, что указывает на то, что VP4 может принимать конформацию, которая более благоприятна для полной реакции при инкапсидировании в CLP, возможно, в результате ассоциации с VP3 внутри слоя субядра.
Тот факт, что VP4 в растворе обладает способностью создавать полную структуру кэпа, был подтвержден последующими экспериментами с использованием аутентичных транскриптов BTV. Как и ожидалось, когда очищенный белок VP4 инкубировали с [α- 32 P] GTP, РНК и AdoMet, структура полной кэпа, т.е.е., m 7 GpppGm, продуцировался на 5′-конце РНК, хотя также были обнаружены промежуточные продукты GpppG и m 7 GpppG. Производство конструкции цоколя 1 m 7 GpppGm, очевидно, является завершающим этапом модификации. Эти данные в целом согласуются с данными Мартина и Мосса (16), которые исследовали образование шапки ядрами вируса осповакцины. Однако ядра вируса осповакцины не давали блокированных 5′-концов в результате ингибирующего действия неорганического пирофосфата на гуанилилтрансферазную реакцию.Однако белок VP4 BTV в присутствии [α- 32 P] GTP продуцировал РНК с блокированной концевой структурой G (5 ‘) pppG. Это согласуется с предыдущим наблюдением, что белок VP4 обладает активностью неорганической пирофосфатазы (26).
Обычно кэппинг считается посттранскрипционной модификацией мРНК. Но данные этих исследований показывают, что, помимо кэппинга существующих молекул РНК, VP4 также может конденсировать GTP с образованием кэпированного динуклеотида, тем самым подтверждая его гуанилилтрансферазную активность.Это обеспечивает альтернативный механизм для кэппирования мРНК (которому может предшествовать образование GpppG из GTP) или для связывания с инициацией синтеза мРНК. Такой сценарий согласуется с биологией BTV, в которой транскрипция и модификация РНК происходят в транскрипционно активном ядре, из которого возникают только зрелые кэпированные мРНК. Кроме того, VP4 представляет собой захватывающий модельный белок, в котором объединены все кэппинговые функции и из которого можно многому научиться с помощью дальнейшего биохимического и структурного анализа.
Благодарности
Авторы благодарны Стефани Прайс за помощь в подготовке рукописи. Признается финансовая поддержка Совета по исследованиям в области биотехнологии и биологических наук (BBSRC) и Министерства сельского хозяйства, рыболовства и продовольствия.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
| BTV | Вирус блютанга | |
| CLP | сердцевинные частицы | |
| AdoMet | S-917-1-921-аденаз| Sylhospin 921-аденоза 9210 921-аденоза | |