Функции дпс приказ 186: 186 приказ дсп — Priuta.ru

автор: alexxlab

Содержание

20. Меры обеспечения личной безопасности ПРИКАЗ МВД РФ от 20.04.99 N 297 «ОБ УТВЕРЖДЕНИИ НАСТАВЛЕНИЯ ПО РАБОТЕ ДОРОЖНО

отменен/утратил силу Редакция от 20.04.1999 Подробная информация
Наименование документПРИКАЗ МВД РФ от 20.04.99 N 297 «ОБ УТВЕРЖДЕНИИ НАСТАВЛЕНИЯ ПО РАБОТЕ ДОРОЖНО — ПАТРУЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ИНСПЕКЦИИ БЕЗОПАСНОСТИ ДОРОЖНОГО ДВИЖЕНИЯ МИНИСТЕРСТВА ВНУТРЕННИХ ДЕЛ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ»
Вид документаприказ
Принявший органмвд рф
Номер документа297
Дата принятия01.01.1970
Дата редакции20.04.1999
Номер регистрации в Минюсте1771
Дата регистрации в Минюсте30.04.1999
Статусотменен/утратил силу
Публикация
  • «Российская газета», N 99, 25.05.99, N 100, 26.05.99, N 103, 01.06.99, N 104, 02.
    06.99
  • «Бюллетень нормативных актов федеральных органов исполнительной власти», N 24, 14.06.99 (без приложений).
НавигаторПримечания

20. Меры обеспечения личной безопасности

20.1. При осуществлении надзора за дорожным движением сотрудник ДПС обязан соблюдать следующие основные меры личной безопасности:

20.1.1. Выбирать место несения службы так, чтобы быть отчетливо видным участникам дорожного движения и иметь возможность для своевременного пресечения правонарушения.

20.1.2. В темное время суток и в условиях ограниченной видимости нести службу на освещенных участках дорог, иметь светящийся жезл и световозвращающее снаряжение.

20.1.3. Избегать нахождения на скользких участках дорожного покрытия.

20.1.4. Выбирать для остановки транспортного средства в темное время суток наиболее освещенный участок дороги, при невозможности — использовать свет фар патрульного транспорта.

20.1.5. Находиться рядом с остановленным транспортным средством следует так, чтобы исключить водителю возможность нанесения сотруднику ДПС удара при резком открытии двери или внезапном начале движения.

20.1.6. Избегать проведения на проезжей части дороги разбора правонарушения, если это создает помехи для движения транспорта или угрозу личной безопасности.

20.1.7. Включать специальные световые сигналы на движущемся патрульном транспорте при остановке транспортных средств участников дорожного движения. При проверке транспортного средства патрульный транспорт следует парковать позади остановленного.

20.2. Не рекомендуется стоять перед или позади остановленного транспортного средства.

20.3. В процессе проверки документов сотрудник ДПС должен выбирать безопасную дистанцию между собой и водителем, не поворачиваться к нему спиной и вести наблюдение за лицами, находящимися в транспортном средстве или рядом с ним. Другие сотрудники, находящиеся в составе наряда, должны занимать положение, позволяющее обеспечивать взаимную страховку.

20.4. В случае обнаружения разыскиваемых транспортных средств или лиц, подозреваемых в совершении преступления, сотрудники, находящиеся в наряде, принимают в зависимости от конкретной обстановки необходимые меры предосторожности при проведении досмотра транспортного средства или личного досмотра задержанных с целью выявления и изъятия оружия.

Досмотр транспортного средства следует проводить после того, как водитель и пассажиры покинули салон автомобиля и за их поведением установлен контроль одним из сотрудников наряда.

20.5. При вынужденном отклонении от предписанного маршрута патрулирования или длительном оставлении поста сотрудник ДПС в обязательном порядке докладывает об этом в дежурную часть строевого подразделения, а при отсутствии такой возможности — на ближайший пост.

20.6. При оформлении ДТП необходимо проконтролировать установку предусмотренных Правилами дорожного движения Российской Федерации аварийных сигнальных средств, при необходимости — выставить дополнительные, а также включить специальные световые сигналы, обеспечить взаимную страховку.

Официальный сайт МО «Мирный» Архангельской области > Версия для печати > Тонировка и закон

Опубликовано: 20-04-2012, 16:18.

Большинство автолюбителей знают об ограничениях по тонировке автомобилей, знают закон, регламентирующий ее уровень. Однако многие водители нарушают этот регламент и платить штрафы за своего неправильно тонированного «железного коня» не хотят, оспаривая справедливость наказания в суде. Вот что по этому поводу говорит начальник ГИБДД ОМВД России по ЗАТО Мирный Юрий Ливенцев

В последнее время резко возросло число протоколов, составленных сотрудниками ГИБДД, за тонировку, которая не соответствует требованиям. Многие водители, недовольные положенным за это наказанием, обжалуют действия наших сотрудников в суде. Однако еще ни одно обжалование не увенчалось успехом. И вот по какой причине: насмотревшись роликов в Интернете и почитав обсуждения на различных форумах, автолюбители начинают неправильно трактовать закон.

В частности, многие считают, что замеры уровня тонировки сотрудники ГИБДД должны проводить на стационарном посту.

Однако эти доводы несостоятельны и носят предположительный характер, поскольку в соответствии с п. 16.1 Наставления по техническому надзору Государственной инспекции безопасности дорожного движения МВД РФ, утвержденного Приказом МВД РФ № 1240 от 7 декабря 2000 года, при надзоре за дорожным движением контроль за конструкцией и техническим состоянием транспортных средств может проводиться на стационарных постах и контрольных постах, контрольно-пропускных пунктах транспортных средств, что в свою очередь не запрещает производить эти действия инспекторам ДПС на маршрутах патрулирования. Согласно п. 11.1 Наставления по организации деятельности дорожно-патрульной службы Государственной службы Государственной инспекции безопасности дорожного движения МВД РФ, утвержденного Приказом МВД РФ № 186 ДСП от 2 марта 2009 года, одной из функций ДПС является контроль на постах и маршрутах патрулирования ДПС за соблюдением участниками дорожного движения Правил дорожного движения, а также в пределах предоставленных полномочий требований иных нормативных правовых актов в области обеспечения безопасности дорожного движения.
Исходя из этого, вывод один – сотрудники ГИБДД могут проводить замер уровня тонировке не только на стационарных постах; были бы специальные приборы, эту процедуру можно производить и на маршрутах патрулирования.

На всякий случай напомню, что такое «правильная» тонировка. Согласно п. 3.5.2. Технического регламента о безопасности колесных транспортных средств, утвержденного Постановлением Правительства Российской Федерации № 720 от 10 сентября 2009 года, светопропускание ветрового стекла, передних боковых стекол и стекол передних дверей (при наличии) должно составлять не менее 70%.

Уважаемые водители! Сотрудники ГИБДД регулярно проводят рейды по выявлению автомобилей с тонировкой, не соответствующей требованиям. В связи с этим, а также в целях безопасности дорожного движения просим вас заранее привести тонировку автомобилей в соответствие действующим нормам. В этом случае никаких претензий у сотрудников ГИБДД к вам быть не может.

Елена Гребцова

Приказ 186 о совершенствовании деятельности гибдд мвд рф :: gondqk

28. 10.2014 13:32 Файл: Приказ 186 о совершенствовании деятельности гибдд мвд рф

образец приказа об исполнение обязанностей генерального директора

tomb raider anniversary инструкция к прохождению yf gthdjv ehjdyt

Приказ МВД РФ№186дсп от 02.03.09 «О мерах по совершенствованию деятельностидорожно- патрульной службы Государственной инспекции 2 марта 2009В целях совершенствования деятельности органов внутренних дел в сфере контроля и надзора за соблюдением участниками дорожного движения требований в области Министр генерал армии Р.НУРГАЛИЕВ. 20 май 2014 Министерство внутренних дел подготовило новый приказ Об будет регулировать деятельность дорожной инспекции ГИБДД МВД России Приказ МВД РФ от 2.03.09 года № 186 дсп «О мерах по совершенствованию деятельности дорожно-патрульной службы. 02 марта 2009 года приказом МВД РФ 185 был утвержден Административный регламент МВД РФ по исполнению государственной функции Вместе с ним был также издан Приказ # 186 »О мерах по совершенствованию деятельности дорожно-патрульной службыПриказ МВД России от 2 марта 2009 г.

Им утверждено Наставление по организации деятельности ДПС. Новый административный регламент ГИБДД (действует с 4 ноября 2012). Приказ МВД России от 2 марта 2009 г. № Шдсп1 ПРИКАЗ от 1 июня 1998 г. Приложение к Приказу МВД России от 02.03.2009 N 185. Приказ 186 мвд. Всего 5 сообщений Всего 4 сообщения Всего 7 сообщений 51.Дежурные части строевых подразделений руководствуются Наставлением по организации деятельности дежурных частей системы органов внутренних дел Российской Федерации, утвержденным приказом МВД России от 26 февраля 2002 г. №186 ДСП «О мерах по совершенствованию деятельности ДПС ГИБДД МВД РФ». Картинки по запросу 186 приказ гибдд скачать. N 329 О РЕФОРМИРОВАНИИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ГОСАВТОИНСПЕКЦИИ МВД РОССИИ. №186 ДСП «О мерах по совершенствованию деятельности ДПС ГИБДД МВД РФ».
детский телесериал повелитель молнии видео онлайн смотреть онлайн, образец отчета среднего медработника для прохождения аттестации, приказ об оформлении лекарственных препаратов подлежащих учету y

организация деятельности и правовое регулирование (стр.

13 из 14)

27. Дорожно-патрульная служба ГИБДД: учебное пособие.- М.: ЦОКР МВД России, 2008.- 334с.

28. Административное право: Часть вторая. Учебник. – М.:ЦОКР МВД России, 2005.-280с.

29. Сальников В.П. Административная деятельность органов внутренних дел: Учебник, М.:ЦЩКР МВД России, 2005. – 163с.

30. Административная деятельность органов внутренних дел. Часть общая. Часть особенная. Учебник. М.: МЮИ МВД России, 2002.

31. Лукьянов В.В. Безопасность дорожного движения. — М.: Транспорт, 2003.

32. Нургалиев Р. Жизнь без страха //Право от 09.10.2009г. №168

33. Перечень изменений, которые вносят в Административного регламента МВД Российской Федерации исполнения государственной функции по контролю и надзору за соблюдением участниками дорожного движения требований в области обеспечения безопасности дорожного движения, утвержденный приказом МВД России от 2 марта 2009г. №185 от Нургалтева. //Российская газета от 5 февраля 2010года № 24

34. Бахрах Д.Н. Административное право. -М 2003.

35. Кирьянов В. Не перечеркивать наработанное а последовательно наращивать усилия // Журнал Профессионал 2009 №5 с.10

36. Буряк Р. «Кодекс чести» дорожных инспекторов //Журнал Право и власть 2009г. №9 с. 22

37. Управление ГИБДД ГУВД по Саратовской области анализ состояния аварийности на территории Саратовской области за период 12 месяцев (01.01.2009 г. по 31.12.2009 г.) Саратов 2009г.

[1] Административное право: Часть вторая. Учебник. – М.:ЦОКР МВД России, 2005.

[2]Приказ МВД РФ от 2 марта 2009г. №186дпс для служебного пользования «Наставлениепо организации деятельности дорожно-патрульной службыГосударственной инспекции безопасности дорожного движения

МВД РФ»

[3] Бахрах Д.Н. Административное право. -М 2003

[4]Приказ МВД РФ от 2 марта 2009г. №186дпс для служебного пользования «Наставлениепо организации деятельности дорожно-патрульной службыГосударственной инспекции безопасности дорожного движения

МВД РФ»

[5]Приказ МВД РФ от 2 марта 2009г. №186дпс для служебного пользования «Наставлениепо организации деятельности дорожно-патрульной службыГосударственной инспекции безопасности дорожного движенияМВД РФ»

[6] Приказ МВД РФ от 8 июня 1999 г. N 410 «О совершенствовании нормативно-правового регулирования деятельности службы дорожной инспекции и организации движения Государственной инспекции безопасности дорожного движения Министерства внутренних дел Российской Федерации»

[7]Приказ МВД РФ от 2 марта 2009г. №186дпс для служебного пользования «Наставлениепо организации деятельности дорожно-патрульной службыГосударственной инспекции безопасности дорожного движенияМВД РФ»

[8] Сальников В.П. «Административная деятельность органов внутренних дел» уч. Гл.34 § 2 М. 2005

[9] Приказ МВД РФ от 7 декабря 2000 г. N 1240 «Об утверждении нормативных правовых актов, регламентирующих деятельность Государственной инспекции безопасности дорожного движения Министерства внутренних дел Российской Федерации по техническому надзору».

[10] Дорожно-патрульная служба ГИБДД: учебное пособие.- М.: ЦОКР МВД России, 2008.- 335с

[11]Приказ МВД РФ от 20 апреля 1999 г. N 297 «Об утверждении Наставления по работе дорожно-патрульной службы Государственной инспекции безопасности дорожного движения Министерства внутренних дел Российской Федерации» (с изменениями от 21 июня 1999 г.)

[12] Приказ МВД России от 1 декабря 2005г. № 985

[13]Приказ МВД РФ от 2 марта 2009г. №186дпс для служебного пользования «Наставлениепо организации деятельности дорожно-патрульной службыГосударственной инспекции безопасности дорожного движенияМВД РФ»

[14] Приказ МВД РФ от 8 июня 1999 г. N 410 «О совершенствовании нормативно-правового регулирования деятельности службы дорожной инспекции и организации движения Государственной инспекции безопасности дорожного движения Министерства внутренних дел Российской Федерации» (в ред. Приказа МВД РФ от 07.07.2003 N 525).

[15]Приказ МВД РФ от 2 марта 2009г. №186дпс для служебного пользования «Наставление по организации деятельности дорожно-патрульной службы Государственной инспекции безопасности дорожного движения МВД РФ»

[16] Безопасность дорожного движения: Сборник научных трудов, выпуск 8. — М.: НИЦ БДД МВД России, 2007.

[17]Приказ МВД РФ от 2 марта 2009г. №186дпс для служебного пользования «Наставление по организации деятельности дорожно-патрульной службы Государственной инспекции безопасности дорожного движения МВД РФ»

[18]Приказ МВД РФ от 31 декабря 2009г. 27 января 2010г. «Регистрационный номер №16074 «О внесении изменений в Административного регламента МВД Российской Федерации исполнения государственной функции по контролю и надзору за соблюдением участниками дорожного движения требований в области обеспечения безопасности дорожного движения, утвержденный приказом МВД России от 2 марта 2009г. №185»

[19] Кирьянов В. Не перечеркивать наработанное а последовательно наращивать усилия // Журнал Профессионал 2009 №5 с.10

[20]Приказ МВД РФ от 31 декабря 2009г. 27 января 2010г. «Регистрационный номер №16074 «О внесении изменений в Административного регламента МВД Российской Федерации исполнения государственной функции по контролю и надзору за соблюдением участниками дорожного движения требований в области обеспечения безопасности дорожного движения, утвержденный приказом МВД России от 2 марта 2009г. №185»

[21]Приказ МВД РФ от 20 апреля 1999 г. N 297 «Об утверждении Наставления по работе дорожно-патрульной службы Государственной инспекции безопасности дорожного движения Министерства внутренних дел Российской Федерации» (с изменениями от 21 июня 1999 г.)

[22]Перечень изменений, которые вносят в Административного регламента МВД Российской Федерации исполнения государственной функции по контролю и надзору за соблюдением участниками дорожного движения требований в области обеспечения безопасности дорожного движения, утвержденный приказом МВДРоссии от 2 марта 2009г. №185 от Нургалтева. //Российская газета от 5 февраля 2010года № 24

[23]Приказ МВД РФ от 31 декабря 2009г. 27 января 2010г. «Регистрационный номер №16074 «О внесении изменений в Административного регламента МВД Российской Федерации исполнения государственной функции по контролю и надзору за соблюдением участниками дорожного движения требований в области обеспечения безопасности дорожного движения, утвержденный приказом МВД России от 2 марта 2009г. №185»

[24]Приказ МВД РФ от 31 декабря 2009г. 27 января 2010г. «Регистрационный номер №16074 «О внесении изменений в Административного регламента МВД Российской Федерации исполнения государственной функции по контролю и надзору за соблюдением участниками дорожного движения требований в области обеспечения безопасности дорожного движения, утвержденный приказом МВД России от 2 марта 2009г. №185»

[25]Приказ МВД РФ от 2 марта 2009г. №186дпс для служебного пользования «Наставление по организации деятельности дорожно-патрульной службы Государственной инспекции безопасности дорожного движения МВД РФ»

[26]См. част 1 статья 27.13 Кодекс Российской Федерации об административных правонарушениях

[27]Инспектор и водитель – М.: ООО «Книжное издательство За рулем» 2008г.

[28]Приказ МВД РФ от 31 декабря 2009г. 27 января 2010г. «Регистрационный номер №16074 «О внесении изменений в Административного регламента МВД Российской Федерации исполнения государственной функции по контролю и надзору за соблюдением участниками дорожного движения требований в области обеспечения безопасности дорожного движения, утвержденный приказом МВД России от 2 марта 2009г. №185»

[29] Часть 4 статьи 5 Закона Российской Федерации «О милиции».

[30]Приказ МВД РФ от 31 декабря 2009г. 27 января 2010г. «Регистрационный номер №16074 «О внесении изменений в Административного регламента МВД Российской Федерации исполнения государственной функции по контролю и надзору за соблюдением участниками дорожного движения требований в области обеспечения безопасности дорожного движения, утвержденный приказом МВД России от 2 марта 2009г. №185»

[31]Статьи 25.6, 25.7 Кодекс Российской Федерации по административным правонарушениям

[32] Буряк Р. «Кодекс чести» дорожных инспекторов //Журнал Право и власть 2009г. №9

[33]Пункт 2.3.3 Правил дорожного движения.

[34]Статьи 12,14 Закона Российской Федерации «О милиции».

[35]Статьи 12,15 Закона Российской Федерации «О милиции».

[36] См. статью 19.3 часть 1 Кодекс Российской Федерации по административным правонарушениям.

[37]Статья 10 Закона Российской Федерации «О милиции».

[38] См. статьи 12.3 часть 1, статьи 12.5 часть 2 Кодекс Российской Федерации по административным правонарушениям.

[39] статья 27.12 Часть 1Кодекс Российской Федерации по административным правонарушениям.

[40]Статья 27.12 Часть 11Кодекс Российской Федерации по административным правонарушениям.

[41] Инспектор и водитель – М.: ООО «Книжное издательство За рулем» 2008

[42]Статьи 27.12 часть 11 Кодекс Российской Федерации по административным правонарушениям.

[43] Инспектор и водитель – М.: ООО «Книжное издательство За рулем» 2008.

Причины остановки автомобиля инспектором — 14 причин (приказ МВД 664)

84. Основаниями для предъявления сотрудником требования об остановке водителем транспортного средства являются:

84.1. Установленные визуально или зафиксированные с использованием технических средств признаки нарушений требований в области обеспечения безопасности дорожного движения.

84.2. Наличие данных (ориентировки, информация дежурного, других нарядов, участников дорожного движения, визуально зафиксированные обстоятельства), свидетельствующих о причастности водителя, пассажиров к совершению ДТП, преступления или административного правонарушения.

84.3. Наличие данных (ориентировки, сведения оперативно-справочных и разыскных учетов органов внутренних дел, информация дежурного, других нарядов, участников дорожного движения) об использовании транспортного средства в противоправных целях или оснований полагать, что оно находится в розыске.

84.4. Необходимость опроса водителя или пассажиров об обстоятельствах совершения ДТП, административного правонарушения, преступления, очевидцами которого они являлись или являются.

84.5. Необходимость привлечения участника дорожного движения в качестве понятого.

84.6. Необходимость использования транспортного средства.
 
84.7. Необходимость временного ограничения или запрещения движения транспортных средств.

84.8. Необходимость обеспечения безопасного и беспрепятственного проезда автомобилей специального назначения.

84.9. Оказание содействия в беспрепятственном проезде к месту происшествия автомобилей скорой медицинской помощи, а также транспортных средств оперативных и иных аварийно-спасательных служб, задействованных в ликвидации чрезвычайных происшествий.

84.10. Необходимость привлечения водителя и (или) пассажиров для оказания помощи другим участникам дорожного движения или сотрудникам полиции.

84.11. Проведение на основании распорядительных актов руководителей территориальных органов МВД России на региональном (районном) уровне, руководителей подразделений Госавтоинспекции территориальных органов МВД России на региональном (районном) уровне мероприятий по предупреждению дорожно-транспортных происшествий и снижению тяжести их последствий в целях охраны жизни, здоровья и имущества граждан, защиты их прав и законных интересов, а также интересов общества и государства.

84.12. Угроза безопасности дорожного движения, создаваемая неисправностью или неправильной установкой технических средств организации дорожного движения, нарушением правил производства ремонтных работ на дороге, стихийным бедствием, производственной (техногенной) аварией, пожаром и другими чрезвычайными обстоятельствами, утечкой опасных веществ.

84.13. Проверка документов на право пользования и управления транспортным средством, документов на транспортное средство и перевозимый груз.

84.14. Проверка документов, удостоверяющих личность водителя и пассажиров, если имеются данные, дающие основания подозревать их в совершении преступления или полагать, что они находятся в розыске, либо если имеется повод к возбуждению в отношении этих граждан дела об административном правонарушении, а равно если имеются основания для их задержания в случаях, предусмотренных федеральным законом.

Dataset registry | data.gov.ru

  • Федеральная служба государственной статистики(6140)

  • Правительство Ханты-Мансийского автономного округа — Югры(1350)

  • Высший исполнительный орган государственной власти города Москвы-Правительство Москвы(1068)

  • Администрация Томской области(916)

  • Министерство транспорта и связи Свердловской области(895)

  • Правительство Тульской области(759)

  • Правительство Ульяновской области(652)

  • Департамент информатизации и связи Краснодарского края(336)

  • Правительство Ярославской области(323)

  • Министерство экономического развития Российской Федерации(315)

  • Правительство Волгоградской области(260)

  • Правительство Вологодской области(196)

  • Федеральная служба государственной регистрации, кадастра и картографии(196)

  • Комитет по информатизации и связи Санкт-Петербурга(181)

  • Федеральное дорожное агентство(179)

  • Федеральное агентство по туризму(143)

  • Федеральная служба по регулированию алкогольного рынка(138)

  • Министерство образования и науки Российской Федерации(137)

  • Министерство промышленности и торговли Российской Федерации(134)

  • Администрация Главы Чувашской Республики(130)

  • Министерство образования и науки Калужской области(125)

  • Федеральная антимонопольная служба(118)

  • Комитет по информатизации Правительства Саратовской области (109)

  • Министерство финансов Российской Федерации(106)

  • Министерство по физической культуре и спорту Республики Саха (Якутия)(105)

  • Министерство культуры Российской Федерации(104)

  • Администрация Краснодарского края(93)

  • Администрация муниципального образования город Новый Уренгой в Ямало-Ненецком автономном округе(93)

  • Министерство энергетики Российской Федерации(91)

  • Министерство природных ресурсов, экологии и охраны окружающей среды Республики Марий Эл(90)

  • Федеральная служба по труду и занятости(90)

  • Городская Управа города Калуги(86)

  • Федеральная налоговая служба(84)

  • Администрация муниципального района «Город Валуйки и Валуйский район»(82)

  • Администрация муниципального образования город Губкинский в Ямало-Ненецком автономном округе(78)

  • Министерство строительства и жилищно-коммунального хозяйства Российской Федерации(71)

  • Администрация Губернатора Брянской области и Правительства Брянской области(63)

  • Комитет информатизации и связи Республики Коми(63)

  • Министерство финансов Республики Башкортостан(63)

  • Федеральная служба по надзору в сфере природопользования(58)

  • Федеральная таможенная служба(57)

  • Администрация города Нижневартовска (55)

  • Администрация муниципального района «Алексеевский район и город Алексеевка»(54)

  • Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации(53)

  • Федеральное агентство воздушного транспорта(53)

  • Департамент строительства и жилищной политики Ямало-Ненецкого автономного округа(48)

  • Министерство спорта Российской Федерации(45)

  • Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения(45)

  • Федеральное агентство морского и речного транспорта(45)

  • Правительство Архангельской области(44)

    • Артем Хохорин начал чистки в ГИБДД?

    Глава МВД по РТ с позором уволил начальника арской ГИБДД, а командира полка ДПС Казани сместил с должности из-за серии дел против подчиненных

    Сразу два кадровых решения за закрытыми дверями коллегии ГИБДД принял глава МВД по РТ Артем Хохорин. По данным источников «БИЗНЕС Online», начальника ОГИБДД по Арскому району Ильдара Нотфуллина министр выгнал из зала за губительную статистику по ДТП, а поводом для отставки командира полка ДПС Казани Алексея Устюгова стала серия уголовных дел, возбужденных следственным комитетом в отношении пятерых сотрудников ДПС на фоне «лихачества» в аэропорту Казани и байкер-скандала в Лаишево.

    Сразу два кадровых решения за закрытыми дверями коллегии ГИБДД принял глава МВД по РТ Артем Хохорин Фото: «БИЗНЕС Online»

    «ПРИ АСГАТЕ САФАРОВЕ ТАКОГО НЕ БЫВАЛО»

    Структуры МВД традиционно закрыты в последние годы, поэтому о том, что происходит там, можно судить только по редким утечкам и осторожным комментариям собеседников. Тем менее напрашивается вывод, что, похоже, Артем Хохорин окончательно покончил с относительной свободой ГИБДД РТ, сложившейся по понятным причинам в эпоху Рифката Минниханова, — таков итог закрытой коллегии ведомства, которая была проведена накануне.

    В первой части совещания была озвучена статистическая информация, содержащая сведения о росте числа ДТП. К примеру, в 2016 году на территории Татарстана было зарегистрировано более 5 тыс. ДТП, в которых погибли 450 человек. В то же время в 2015 году в республике произошло меньше ДТП — 4,95 тыс., но жертв в них было больше — 492 человека. «Мы добились снижения числа погибших на дорогах на 42 человека, но цифра остается большой, будем работать по ней, — заметил в разговоре с „БИЗНЕС Online“ один из сотрудников ГИБДД. — В самой Казани 52 погибших за минувший год — это один из самых низких показателей в городах-миллионниках».

    После доклада Ленара Габдурахманова перед присутствующими уже в должности руководителя ГБУ «Безопасность дорожного движения» итоги года озвучил бывший глава республиканской ГИБДД Минниханов. Помимо него на коллегии также присутствовали министр внутренних дел по РТ Артем Хохорин, заместитель руководителя следственного комитета РФ по РТ Ильяс Масаллимов, заместитель председателя Верховного суда РТ Роман Гафаров, заместитель прокурора РТ Сергей Старостин, руководитель УФССП по РТ Радик Ильясов, депутат Государственного Совета РТ пятого созыва Рафил Нугуманов, главный государственный инспектор Госавтодорнадзора по РТ Борис Смирнов.

    Но гораздо более значимые события произошли на второй части коллегии, которая была проведена в узком кругу руководителей подразделений. Там, как нам рассказали сразу несколько собеседников, Хохорин объявил об увольнении командира полка ДПС Казани Алексея Устюгова и начальника отдела ГИБДД по Арскому району Ильдара Нотфуллина. Причем последнего министр удалил из зала в самом начале совещания. «За 20 лет службы я впервые сталкиваюсь с тем, что министр удалил руководителя из зала. При Асгате Сафарове такого не бывало, это беспрецедентный случай», — поделился с корреспондентом «БИЗНЕС Online» своими впечатлениями один из участников коллегии.

    Ильдара Нотфуллина министр удалил из зала в самом начале совещания Фото: arsk.tatarstan.ru

    Кстати, из-за недостатка информации картина сложилась противоречивая. Так, ряд СМИ поспешил высказать версию о том, что в отношении руководителя арской ГИБДД была проведена служебная проверка, которая установила, что Нотфуллин передал подчиненным пароли от приборов видеонаблюдения «Армата», что якобы позволяло им удалять видеозаписи с нарушениями. Таким образом, он создал почву, способствующую коррупционным проявлениям. «Я читал информацию о том, что переданы пароли, но не понял, что там написано, — прокомментировал это предположение Габдурахманов в разговоре с „БИЗНЕС Online“. — Якобы он отдал пароли. Но какие пароли? У нас есть приборы, мы осуществляем их контроль, за приборами закреплены инспекторы. А по поводу того, что он [Нотфуллин] какие-то пароли дал, я ничего сказать не могу. У него и без того есть взыскания, которые в совокупности послужили поводом для увольнения». По словам Габдурахманова, к Нотфуллину возникали многочисленные вопросы по итогам 2015 и первого полугодия 2016 года. «Это рост аварийности по всем показателям, увеличение числа погибших в ДТП и ДТП, совершенных в нетрезвом состоянии, — перечислил Габдурахманов. — Были проведены служебные проверки по многим фактам, после чего принято решение».

    По сведениям источника «БИЗНЕС Online» в правоохранительных органах, в арском управлении ГИБДД история завершилась служебной проверкой, до возбуждения уголовного дела не дошло, тогда как у кадрового решения в отношении Устюгова есть ощутимый уголовный подтекст. «Министр на совещании высказался о том, что есть зашкаливающее количество уголовных дел, возбужденных в этом месяце управлениями следственного комитета по Вахитовскому и Советскому районам в отношении сотрудников ДПС, — добавил присутствовавший на коллегии собеседник издания. — Поэтому решение по Устюгову было принято с учетом данного обстоятельства, а остальным сотрудникам министр порекомендовал сделать выводы. Однако в отношении начальника полка ДПС Хохорин поступил гораздо мягче. Он просто освободил его от занимаемой должности с формулировкой „посмотреть себя в другом качестве в ГИБДД, поскольку руководство полком не очень получилось“».

    АЛЕКСЕЙ УСТЮГОВ ПОПАЛ ПОД КОЛЕСА АВТОЛИХАЧА КАЗАНСКОГО АЭРОПОРТА?

    По сведениям «БИЗНЕС Online», следственный комитет РФ по РТ действительно возбудил два уголовных дела. Расследование первого было начато около месяца назад в отношении четырех сотрудников казанского полка ДПС. Фигурантом второго является еще один, пятый по счету подчиненный Устюгова.

    Впрочем, другие источники «БИЗНЕС Online» указывают на то, что отставка Устюгова связана с серией факторов, которые накапливались в течение всего 2016 года, когда Хохорин пристально к нему приглядывался. В их числе неудовлетворительные отношения с казанскими байкерами, а также прогремевший на всю страну эпизод с гонщиком, который прорвался на территорию казанского аэропорта. В конце декабря прошлого года двое сотрудников ДПС, включая командира 2-го взвода 2-го батальона полка ДПС ГИБДД, были уволены. Всего «под колеса» автолихача попали 15 сотрудников автоинспекции, получивших дисциплинарные взыскания за непрофессиональные действия и ненадлежащее исполнение обязанностей. Не исключено, что наказание спустя месяц настигло и их командира…

    Отметим, что начальник полка ДПС — должность отнюдь не рядовая в системе ГИБДД РТ и даже в республиканском МВД. В Татарстане всего один полк ДПС, созданный в 1998 году. Дислоцируется он в управлении ГИБДД по РТ на Оренбургском тракте, 8. Командиром полка может стать человек в звании не ниже подполковника. Устюгов, к примеру, носил полковничьи погоны, очередное звание он получил в феврале 2014 года, хотя возглавил полк еще в 2012 году. Примечательно, что на этом посту он сменил нынешнего заместителя руководителя ГИБДД РТ Рустема Ибрагимова, командовавшего казанскими дэпээсниками с 2007 по 2012 год. Помимо полка ДПС в состав ГИБДД входит особый батальон ДПС, которым, в свою очередь, с 2004 по 2015 год командовал Габдурахманов. Учитывая, что через год он сел в кресло руководителя республиканской ГАИ, по статусу на эту позицию мог претендовать и Устюгов. Однако предпочтение отдано все же Габдурахманову.

    «По уровню полномочий и должности Устюгов практически равен начальнику управления УМВД по Казани Алексею Соколову, — отмечает собеседник „БИЗНЕС Online“, знакомый с работой республиканской ГИБДД. — Хотя в подчинении у Соколова, конечно же, больше сотрудников, он прямой руководитель начальника полка ДПС».

    «Устюгов закончил танковое училище, он кадровый военный, с дисциплиной у него все в порядке, вредных привычек нет, у него есть более 30 наград, в том числе на 80-летие ГИБДД он получил государственную награду из рук президента РТ Рустама Минниханова, — вспомнил один из сослуживцев теперь уже бывшего командира полка ДПС Казани. — Это один из немногих руководителей, который находится на своем месте в ГИБДД. Его подчиненные каждую ночь совершают маленький подвиг, задерживая нетрезвых водителей, преследуя тех, кто не останавливается по требованию. Это выматывающая ночная работа, которую обыватель не видит. Да, был эпизод с аэропортом, но принимать такое решение через два месяца не совсем своевременно и несоразмерно. Впрочем, не исключено, что руководство видит и другие прорехи в работе».

    Рифкат Минниханов кадровые решения проводил без лишнего шума, внутри «своей кухни» Фото: tatarstan. ru

    Отнюдь не рядовое, но далеко не самое громкое кадровое решение Хохорина получило едва ли не сенсационный окрас в первую очередь в связи с историческим контекстом татарстанского управления ГИБДД. В эпоху 19-летнего правления УГИБДД по РТ Рифката Минниханова представить что-то подобное было сложно. Во-первых, благодаря авторитету самого Минниханова, который в рядах автоинспекции провел почти четверть века, то есть МВД осторожно вмешивалось в эту епархию, «государство в государстве». Даже при всесильном Сафарове. Во-вторых, благодаря управленческим способностям самого главного автоинспектора республики. Как отмечает один из собеседников «БИЗНЕС Online», Минниханов кадровые решения проводил без лишнего шума, внутри «своей кухни». Впрочем, его «дозор» на посту руководителя ведомства 8 августа был окончен, когда он объявил о собственном решении покинуть органы. Правда, далеко бессменный экс-руководитель ГИБДД РТ все же не ушел, остановившись на посту начальника ГБУ «Безопасность дорожного движения».

    «Ушла эпоха», — обобщают последние кадровые изменения в рядах высокопоставленных автоинспекторов собеседники «БИЗНЕС Online». Таким образом, ГИБДД РТ возвращается в статус рядового управления республиканского министерства внутренних дел, а Хохорин в новой ситуации вынужден в «ручном режиме» реагировать на происходящее в этом особом «государстве в государстве».

    «В ОТНОШЕНИИ СОТРУДНИКОВ МВД В ПРОШЛОМ ГОДУ ЗАВЕЛИ ПОД 90 УГОЛОВНЫХ ДЕЛ»

    Эксперты, опрошенные «БИЗНЕС Online», выразили свое отношение к последним кадровым решениям Хохорина.

    Рафил Нугуманов — депутат Государственного Совета РТ пятого созыва, общественный уполномоченный по реализации экономической амнистии в РТ:

    — Не порадовало в ходе совещания, конечно, незначительное увеличение количества ДТП. А вот количество погибших и раненых, напротив, снизилось, причем неплохо. Тем не менее по итогам прошлого года, к сожалению, на дорогах погибли 450 человек. Снижение погибших должно быть нормой. Побольше, правда, стало появляться на дорогах пьяных водителей. В кадровый вопрос я не вникал, потому что был только на официальной части. Я не могу прокомментировать, потому что не знаю, гадать не буду. Есть масса вопросов, над которыми еще надо работать, возбуждаются уголовные дела в отношении сотрудников ГИБДД. Отдельно насчет ГИБДД не знаю, но в целом в отношении сотрудников МВД в прошлом году завели под 90 уголовных дел! Конечно, если совершено серьезное преступление, была взятка, то такие сотрудники должны идти под суд. Нужно изживать грубость. При всей строгости штрафы должны быть законными, а когда гражданин понимает свою вину, то и зла не держит на сотрудников. Госавтоинспекция вплотную работает с народом, отношение к МВД напрямую зависит от отношения населения к ГИБДД. Инспекции министр всегда уделял особое внимание. С учетом того, что ушел человек с огромным опытом работы, а пришел молодой, министру, даже если бы он не хотел, пришлось бы еще больше внимания уделять службе ГИБДД. Конечно, я считаю, что внимания уделяется больше.

    Дмитрий Золотов — представитель ФАР в Казани:

    — Напрямую с Устюговым мы не сталкивались, не разговаривали с ним. В основном мы работали с Ибрагимовым, когда он был начальником полка ДПС и когда он стал заместителем начальника УГИБДД МВД по РТ. А Устюгову мы писали письма по нарушениям водителей VIP’ов и крупных чиновников, и нам приходили ответы. Таких водителей наказывали. В плане этой работы у нас к нему претензий не было, все было в порядке. Но у нас было много вопросов по дорожным знакам — несуществующим, неправильно установленным. И эти вопросы никуда не делись, они остались. Я не знаю, вина ли это Устюгова или кого-нибудь другого. Скорее всего, именно его.

    Dps защищает клетки от множественных стрессов во время стационарной фазы

    РЕЗЮМЕ

    Dps, неспецифический ДНК-связывающий белок из голодных клеток, является наиболее распространенным белком в стационарной фазе Escherichia coli . Гомологи Dps обнаруживаются во всех бактериях и по крайней мере у одного вида архей. Было показано, что Dps защищает клетки от окислительного стресса во время экспоненциальной фазы роста. Во время стационарной фазы Dps организует хромосому в высокоупорядоченный стабильный нуклеопротеидный комплекс, называемый биокристаллом.Мы показываем здесь, что Dps необходим для долгосрочной жизнеспособности в стационарной фазе в конкурентных условиях, и что dps мутантов имеют измененные лаг-фазы по сравнению с клетками дикого типа. Мы также показываем, что во время стационарной фазы Dps защищает клетку не только от окислительного стресса, но также от УФ и гамма-излучения, токсичности железа и меди, теплового стресса, а также кислотного и основного шока. Защитные роли Dps, скорее всего, достигаются за счет комбинации функций, связанных со связыванием белок-ДНК и уплотнением хромосом, хелатированием металлов, активностью ферроксидазы и регуляцией экспрессии генов.

    Dps, ДНК-связывающий белок из голодных клеток, является одним из наиболее распространенных белков в стационарной фазе Escherichia coli . Когда клетки переходят от экспоненциально-фазового роста к стационарной фазе, Dps индуцируется RpoS-зависимым образом, достигая до 200000 молекул на клетку (2). Dps также регулируется OxyR и σ 70 в ответ на окислительный стресс во время экспоненциальной фазы (3). Белок обладает неспецифической ДНК-связывающей активностью, влияет на экспрессию не менее трех десятков генов и играет роль в различных стрессовых ответах, включая защиту от окислительного повреждения (2, 18).Активная форма белка представляет собой полый сферический додекамер с внешним диаметром ∼90 Å и внутренним диаметром ядра ∼45 Å (2, 27). Во время стационарной фазы Dps связывает хромосому, образуя высокоупорядоченный и стабильный нуклеопротеидный комплекс, называемый биокристаллом. Эта биокристаллическая форма отличается от экспоненциально-фазовой конфигурации нуклеоида и уникальна для клеток с неподвижной фазой (12, 19, 27). Формирование биокристаллов способствует способности Dps влиять на экспрессию генов и защищает хромосомную ДНК. Dps демонстрирует значительную структурную гомологию с ферритинами, высококонсервативным семейством белков, обнаруженных практически во всех организмах, и обладает ферроксидазной активностью и способностью связывать железо (15). Эта железосвязывающая активность очень вероятно играет важную роль в способности Dps защищать хромосому от окислительного повреждения.

    Для E. coli большинство исследований Dps было сосредоточено на его роли в защите от окислительного повреждения, особенно от пероксидов, во время экспоненциальной фазы (2, 18).Здесь мы расширяем репертуар потенциальных стрессоров, чтобы включить длительную инкубацию в стационарной фазе в условиях стресса и конкуренции с питательными веществами, присутствия окислителей и тяжелых металлов, теплового стресса, ионизирующего и УФ-излучения, а также экстремальных значений pH. Наша рабочая гипотеза заключается в том, что этот многофункциональный белок участвует во многих клеточных процессах и, вероятно, действует через несколько различных механизмов. Во-первых, посредством прямого взаимодействия Dps-ДНК белок защищает ДНК, изолируя хромосому в высокостабильный биокристаллический комплекс.Dps может также напрямую защищать ДНК, выступая в качестве альтернативной мишени для реактивных агентов. Во-вторых, белок снижает производство окислительных радикалов, которые могут повредить ДНК и белок, связывая и минерализируя ионы металлов, особенно двухвалентного железа, которые могут участвовать в реакции Фентона (9, 26). В-третьих, Dps может нейтрализовать токсичные пероксиды благодаря своей ферроксидазной активности. Наконец, Dps может регулировать экспрессию генов, необходимых для длительного выживания и стрессовых реакций клеток в стационарной фазе.Мы решили проверить эту гипотезу, определив относительную чувствительность клеток дикого типа и мутантных клеток dps к широкому спектру стрессов окружающей среды.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Бактериальные штаммы и плазмиды. Все эксперименты проводились со штаммами, происходящими от E. coli K-12 штамма ZK126 (28), и перечислены в таблице 1. Плазмида pJE106 включает ген dps с собственный регуляторный регион (2).

    ТАБЛИЦА 1.

    Бактериальные штаммы

    Условия культивирования, среды и анализы титрования.Все штаммы культивировали в 5 мл бульона Лурия-Бертани (LB) (Difco) и инкубировали при 37 ° C с аэрацией в роликовом тестере, если не указано иное. Подсчет жизнеспособных клеток определяли серийным разведением клеток, периодически удаляемых из культуры, с последующим посевом на агар LB, содержащий соответствующий антибиотик (ы). Использовали антибиотики в следующих концентрациях: налидиксовая кислота 20 мкг / мл; стрептомицин, 25 мкг / мл; хлорамфеникол, 30 мкг / мл; канамицин, 50 мкг / мл; ампициллин, 150 мкг / мл. Все химические вещества были получены от Sigma-Aldrich.

    Анализы конкуренции на долгосрочном росте, лаг-фазе и стационарной фазе. Для измерения долговременной выживаемости отдельных штаммов 5-миллилитровые бульонные культуры LB инокулировали 1: 1000 (объем: объем) из свежих ночных культур, начатых непосредственно из замороженные бульоны LB-глицериновые смеси. Эти монокультуры инкубировали и периодически определяли количество жизнеспособных культур. Для определения продолжительности лаг-фазы клеток, покидающих долгосрочную стационарную фазу инкубации, культуры первоначально инокулировали, как описано выше, и инкубировали в течение 10 дней.Каждые 24 ч отбирали 10 мкл клеток и использовали для инокуляции новых 5-мл культур бульона LB. Затем каждые 30 мин в течение 5 часов определяли количество жизнеспособных клеток и оптическую плотность при 600 нм. Время задержки рассчитывали как время от инокуляции до начала экспоненциального роста, которое определяли путем интерполяции линии через временные точки экспоненциальной фазы и отметки точки перегиба относительно горизонтальной линии, представляющей начальную плотность. Все эксперименты по фазе роста и конкуренции проводились не менее трех раз.Определение лаг-фазы проводилось четыре или пять раз.

    Для определения относительной пригодности штаммы дикого типа, мутантные и / или трансформированные плазмидой, несущие различные маркеры устойчивости к антибиотикам, коокулировали 1: 1000 (об. : Об.) Из свежих ночных культур. Титры индивидуальных субпопуляций определяли после периодического отбора проб, серийных разведений и посева на среду, содержащую соответствующие антибиотики. Для экспериментов, в которых определялась относительная пригодность штаммов, несущих плазмиды, экспрессирующие dps , в каждую временную точку серийные разведения высевали на агар, содержащий либо только канамицин, канамицин и ампициллин, только хлорамфеникол, либо хлорамфеникол и ампициллин.Посев клеток на среду, содержащую одно лекарство по сравнению с двумя лекарствами, позволяет определить степень потери плазмиды. Для всех экспериментов предел обнаружения составляет <1000 КОЕ / мл.

    Анализы окислительного стресса. Ночные стационарные культуры клеток дикого типа или dps мутантных клеток инкубировали при 37 ° C с аэрацией в присутствии или отсутствии перекиси водорода в концентрациях до 400 мМ. После добавления H 2 O 2 (который становится нулевым моментом в эксперименте) периодически определяли количество жизнеспособных клеток. Все анализы проводились не менее трех раз.

    УФ и гамма-облучение. Ночные стационарные культуры клеток дикого типа или dps мутантных клеток подвергали воздействию УФ-света. Пятимиллилитровые культуры переносили в стерильную чашку Петри диаметром 10 см, помещали под бактерицидную лампу (254 нм, 30 Дж / м 2 ) и периодически отбирали пробы в течение до 5 мин. После воздействия образцы хранили на льду до определения количества жизнеспособных клеток. Все УФ-эксперименты проводились пять раз.

    Ночные стационарные культуры клеток дикого типа или dps мутантных клеток подвергали воздействию гамма-излучения в дозе до 700 Гр в Лаборатории реактивного движения, Пасадена, Калифорния. Один миллилитр каждой культуры переносили в микроцентрифужные пробирки и подвергали воздействию без встряхивания при температуре окружающей среды. Количество облучения было пропорционально времени воздействия. После воздействия образцы хранили на льду до определения количества жизнеспособных клеток. Эксперименты по гамма-облучению проводились дважды.

    Металлический стресс-анализ. Экспоненциально-фазовые или стационарные культуры клеток дикого типа или dps мутантных клеток инкубировали при 37 ° C с аэрацией в присутствии или в отсутствие различных металлов в следующих концентрациях: FeSO 4 , От 5 до 10 мМ в логарифмической фазе и от 20 до 200 мМ в стационарной фазе; CuSO 4 , от 5 до 10 мМ; От 50 до 100 мМ; MnCl 2 , от 50 до 100 мМ и 100 мМ; SnCl 2 , от 50 до 100 мМ и от 50 до 100 мМ; K 2 Cr 2 O 7 , от 5 до 10 мМ и 100 мМ; Pb (NO 3 ) 2 , от 50 до 100 мМ и от 50 до 100 мМ; Na 2 SeO 3 , от 5 до 10 мМ и от 50 до 100 мМ; CdCl 2 , от 5 до 500 мМ и от 250 до 500 мМ; NiSO 4 , от 5 до 10 мМ и от 250 до 500 мМ; HgCl 2 , от 5 до 10 мМ и от 50 до 100 мМ.После добавления металлического раствора (который в эксперименте становится нулевым) периодически определяли количество жизнеспособных клеток. Все анализы напряжения металла были выполнены в двух экземплярах.

    Для определения чувствительности клеток к металлам во время лог-фазы роста ночные культуры инокулировали 1: 500 (объем: объем) в свежий бульон LB и выращивали в течение 2 часов. Затем культуры обрабатывали металлами и периодически определяли количество жизнеспособных.

    Температурный стресс. Клетки дикого типа или dps мутантных клеток инкубировали в течение ночи при 37 ° C.Затем культуры переносили на водяную баню со встряхиванием при температуре от 45 до 60, 4 или 18 ° C. Периодически определяли количество жизнеспособных клеток. Все анализы были выполнены четыре раза.

    Для экспериментов по тепловой адаптации клетки сначала выращивали, как описано выше. Затем мутантные культуры дикого типа или dps были переведены на температуру 53 ° C на 10 мин, а затем на 55 ° C. Периодически определяли количество жизнеспособных клеток. Эксперименты проводились в двух экземплярах.

    pH-стресс. Ночные стационарные культуры клеток дикого типа или dps мутантных клеток инкубировали при 37 ° C с аэрацией в среде, доведенной до pH 2 с помощью 10% HCl или до pH 12 с помощью 5 N NaOH. После сдвига pH (который в эксперименте становится нулевым) периодически определяли количество жизнеспособных клеток. Все анализы стресса pH проводили в двух экземплярах.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    dps требуется для длительного выживания в стационарной фазе во время соревнований в сокультуре, но не в монокультуре.Поскольку Dps максимально экспрессируется во время стационарной фазы, мы хотели определить, требуется ли белок для выживания в стационарной фазе. Мутантные клетки дикого типа или dps инокулировали в монокультуре в бульон LB и инкубировали при 37 ° C (фиг. 1A). Количество жизнеспособных клеток как дикого типа, так и мутантных клеток сопоставимо в течение 10 дней инкубации, первоначально достигая ~ 10 9 КОЕ / мл при переходе в стационарную фазу и снижаясь до ~ 10 7 КОЕ / мл после прохождения фазы гибели. Количество жизнеспособных клеток остается на уровне ~ 10 7 КОЕ / мл в течение более 15 дней непрерывной инкубации периодических культур без добавления питательных веществ (данные не показаны).

    РИС. 1.

    Модели долгосрочного выживания и конкуренции. (А) Наложение кривых роста клеток, выращенных отдельно в монокультуре. WT, дикий тип. (B) Конкурентный анализ клеток, выращенных в сокультуре. (C) Конкуренция нуль-мутантов dps , содержащих dps -экспрессирующих (pJE106) или контрольных (pBR322) плазмид.Сплошные символы, SF2049 (pJE106-Dps + ), нанесенный только на канамицин (квадраты) или на канамицин и ампициллин (круги). Открытые символы, SF2043 (pBR322-Dps —), нанесенный только на хлорамфеникол (квадраты) или на хлорамфеникол и ампициллин (кружки). Звездочки указывают на отсутствие обнаруживаемых клеток (предел обнаружения <1000 КОЕ / мл). Показаны репрезентативные данные.

    Напротив, когда мутантные клетки dps дикого типа и мутантные клетки dps совмещают в одну культуру, мутанты dps демонстрируют специфический для стационарной фазы конкурентный дефект (9; R. Яламанчили и С.Э. Финкель, неопубликованные данные). Эта неспособность соревноваться наблюдается в двух типах соревновательных экспериментов. Во-первых, когда в течение ночи культуры стационарной фазы как клеток дикого типа, так и мутантных клеток смешивают в соотношении 1: 1, а затем позволяют продолжить инкубацию в стационарной фазе, мутантная популяция начинает сокращаться по сравнению с диким типом после 1 дня совпадения (рис. . 1Б). Через 3 дня титры мутантов dps составляют <1% от максимальной плотности клеток, а через 7 дней мутанты dps больше не обнаруживаются в культуре; клетки дикого типа поддерживают ~ 10 7 КОЕ / мл.По существу, такие же результаты наблюдаются, когда свежая культура бульона LB инокулируется 1: 1000 равным количеством мутантных клеток дикого типа и dps . Титры обеих субпопуляций первоначально достигают одинаковой плотности ~ 10 9 КОЕ / мл в стационарной фазе, а затем мутантная популяция dps постепенно снижается до тех пор, пока через 7-10 дней клетки не обнаруживаются (данные не показаны).

    Специфический для стационарной фазы дефект конкуренции мутантов dps может быть устранен путем экспрессии Dps из плазмиды.Когда проводятся долгосрочные эксперименты по инкубации с использованием монокультуры мутантов dps и , несущих либо Dps-экспрессирующую плазмиду, либо контрольную плазмиду, ни один из штаммов не показывает разницы в выживаемости в стационарной фазе по сравнению с клетками без плазмиды (данные не показаны). Однако, когда мутант dps , несущий плазмиду с геном dps (pJE106), конкурирует в сокультуре со штаммом dps , несущим контрольную плазмиду (pBR322), штамм с контрольным вектором уступает клеткам, экспрессирующим dps (рис.1С). dps мутантов, несущих контрольную плазмиду, не только не в состоянии конкурировать, но также теряют векторную плазмиду с течением времени (когда эксперименты проводят в отсутствие выбора лекарственного средства), предполагая, что экспрессия Dps помогает поддерживать плазмиду (данные не показаны). Эти результаты демонстрируют, что мутанты dps выживают в монокультуре, но не могут конкурировать со штаммами дикого типа в среде с ограниченным питанием.

    Различия лаг-фазы между мутантами dps и клетками дикого типа после инкубации в стационарной фазе.Известно, что нуклеоидные структуры клеток дикого типа и мутантных клеток dps значительно различаются в стационарной фазе (10). Клетки, экспрессирующие Dps, образуют высокоупорядоченный биокристалл, а нуклеоид у мутантов dps переходит в высокостабильную гелеобразную холестерическую фазу во время длительного культивирования (12, 17). Как сообщалось ранее, при нанесении на свежий питательный агар мутанты dps из 6-дневных культур образуют колонии медленнее, чем клетки дикого типа (12). Это наблюдение привело нас к изучению эффекта Dps во время выхода из долгосрочной стационарной фазы путем определения длины лаг-фазы.

    Мутантные клетки дикого типа или dps инокулировали в бульон LB и инкубировали при 37 ° C в течение 10 дней. Каждый день из каждой культуры отбирали по 10 мкл и инокулировали в свежую среду. Затем определяли время запаздывания и скорость роста экспоненциальной фазы. Мутанты Dps имеют увеличенный лаг-период по сравнению с клетками дикого типа в течение первых 2 дней длительной инкубации в стационарной фазе, что примерно вдвое больше, чем наблюдается для клеток дикого типа (рис. 2; таблица 2). Удивительно, но через 3 дня инкубации время задержки до 6 дня было одинаковым.По прошествии этого времени, когда возраст инокулята увеличивается, время задержки dps мутантных культур снова увеличивается по сравнению с культурами дикого типа до 9 дня (таблица 2). Хотя продолжительность лаг-фазы различается, как только клетки входят в экспоненциальную фазу, темпы роста и конечная плотность клеток сравнимы с таковыми для клеток дикого типа, а после инкубации в течение ночи плотности достигают ~ 10 9 КОЕ / мл.

    РИС. 2.

    Сравнение лаг-фаз дикого типа (WT) и dps мутантных клеток из однодневных культур стационарной фазы. Показано наложение кривых роста клеток, выращенных отдельно в монокультуре.

    ТАБЛИЦА 2.

    Время задержки штаммов дикого типа и dps

    dps Мутанты чувствительны к окислительному стрессу во время стационарной фазы. Большинство исследований чувствительности к окислительному стрессу мутантов dps было сосредоточено на клетках с экспоненциальной фазой. Здесь мы исследуем стационарные культуры. Ночные культуры клеток дикого типа или мутантных клеток dps обрабатывали перекисью водорода и определяли характер выживаемости.В отличие от клеток с экспоненциальной фазой, которые уничтожаются H 2 O 2 при концентрациях выше 50 мМ, стационарные клетки дикого типа и мутантные клетки dps устойчивы к перекиси водорода более 3 часов при концентрациях до 200 мМ. Выше этих концентраций мутанты dps начинают проявлять повышенную чувствительность к перекиси водорода. dps мутантов, обработанных 400 мМ H 2 O 2 , теряют жизнеспособность через 30 минут обработки, тогда как клетки дикого типа сохраняют жизнеспособность на уровне ~ 10 6 КОЕ / мл в течение ~ 90 минут (рис. 3).

    РИС. 3.

    Стресс перекиси водорода. Ночные культуры клеток дикого типа (WT; квадраты) или dps (кружки) обрабатывали 400 мМ H 2 O 2 . Сплошные символы, необработанные клетки; открытые символы, клетки, обработанные перекисью. Звездочки указывают на отсутствие обнаруживаемых клеток (предел обнаружения <1000 КОЕ / мл). Показаны репрезентативные данные.

    Мутанты dps чувствительны к УФ-облучению. Стационарные культуры клеток дикого типа или dps мутантных клеток подвергали УФ-облучению и определяли характер выживаемости. dps Мутанты более чувствительны к УФ-свету, чем клетки дикого типа (рис. 4). После 30 секунд воздействия погибает более 99% клеток dps по сравнению с 90% клеток дикого типа. После 60 секунд воздействия жизнеспособность мутантных клеток еще больше снижается по сравнению с жизнеспособностью клеток дикого типа. Через 3 минуты количество клеток дикого типа составляет ~ 10 6 КОЕ / мл, в то время как мутанты dp s не обнаруживаются.

    РИС. 4.

    УФ-стресс. Ночные культуры клеток дикого типа (WT) или dps подвергали воздействию УФ-излучения.Звездочки указывают на отсутствие обнаруживаемых клеток (предел обнаружения <1000 КОЕ / мл). Показаны репрезентативные данные.

    Мутанты dps чувствительны к гамма-облучению. Стационарные культуры мутантных клеток или клеток дикого типа dps подвергались воздействию гамма-излучения. Смертельная доза облучения для E. coli во время экспоненциальной фазы составляет примерно от 30 до 70 Гр (10). Во время стационарной фазы клетки дикого типа полностью теряют жизнеспособность выше ∼700–1000 Гр. dps Мутанты более чувствительны к гамма-облучению на всех уровнях воздействия, постоянно показывая в 10 раз меньшую выживаемость при облучении 300 Гр и выше (рис.5).

    РИС. 5.

    Гамма-радиационный стресс. Ночные культуры клеток дикого типа (WT) или dps подвергали гамма-облучению. Показаны репрезентативные данные.

    Мутанты dps демонстрируют дифференциальную чувствительность к определенным металлам во время стационарной фазы и экспоненциальной фазы. Стационарные культуры клеток дикого типа и dps мутантных клеток обрабатывали различными металлами. Обработка кадмием, хромом, свинцом, ртутью, марганцем, никелем, селеном и оловом не выявляет специфического для Dps эффекта; клетки дикого типа и мутантные клетки dps демонстрируют сходную чувствительность (данные не показаны).Значительный Dps-специфический эффект наблюдается при обработке железом или медью во время стационарной фазы. После 45 мин обработки 100 мМ железа плотности клеток дикого типа составляют 10 7 КОЕ / мл, в то время как титры мутантов снижаются до ~ 10 3 КОЕ / мл (фиг. 6A). После 80 мин обработки dps мутантов не обнаруживаются; клеткам дикого типа требуется в два раза больше времени, чтобы полностью потерять жизнеспособность. Dps-специфический эффект также наблюдался в логарифмической фазе. Во время ранней логарифмической фазы мутантные клетки dps более чувствительны, чем клетки дикого типа, при обработке 5-10 мМ Fe 2+ (рис. 6Б).

    РИС. 6.

    Напряжение металла во время стационарной фазы и каротажной фазы. Клетки дикого типа (WT; квадраты) или dps (кружки) обрабатывали железом (A и B) или медью (C и D) во время стационарной фазы (A и C) или логарифмической фазы (B и D). Открытые символы, обработка металла; закрашенные символы, элементы управления без обработки. Звездочки указывают на отсутствие обнаруживаемых клеток (предел обнаружения <1000 КОЕ / мл). Показаны репрезентативные данные.

    При обработке 50 мМ меди культуры в стационарной фазе мутантов dps полностью теряют жизнеспособность через 30 мин воздействия, тогда как клеткам дикого типа требуется ~ 90 мин для потери жизнеспособности (рис.6С). Однако, в отличие от того, что было обнаружено для обработки железом, мутанты dps не обнаруживают значительного увеличения чувствительности к меди во время роста в экспоненциальной фазе (рис. 6D).

    Обработка цинком демонстрирует dps -специфический эффект только во время перехода от поздней экспоненциальной фазы к стационарной фазе. При обработке 100 мМ цинка титры мутантных клеток снижаются более чем в 100 раз (с 10 6 до 10 4 КОЕ / мл), тогда как титры дикого типа уменьшаются только в 10 раз (с 10 7 до 10 6 КОЕ / мл).Это специфическое для Dps различие в выживаемости не наблюдается в культурах в ранней экспоненциальной фазе или стационарной фазе (данные не показаны).

    dps Мутанты чувствительны к термическому стрессу и не проявляют температурно-зависимой тепловой адаптации. Ночные стационарные культуры клеток дикого типа или dps мутантных клеток были переведены на температуру инкубации от 45 до 60 ° C, после чего клетки Жизнеспособность определяли каждые 5 мин в течение 1 ч. При 45 ° C не наблюдали разницы в жизнеспособности между клетками дикого типа и dps мутантных клеток.При 50 и 53 ° C жизнеспособность клеток дикого типа в 10 раз выше, чем у мутантов после 90 мин воздействия. Через 15 мин при 55 ° C наблюдается 100-кратная разница в выживаемости между клетками дикого типа и dps мутантами; Титры мутантов падают до 10 7 КОЕ / мл, тогда как титры дикого типа остаются на уровне 10 9 КОЕ / мл (рис. 7). Еще через 15 минут титры dps клеток уменьшаются до 10 5 КОЕ / мл, а через 45 минут титры не определяются; клетки дикого типа выживают около 60 мин.Через 5 мин при 58 ° C клетки дикого типа показывают титры 10 4 КОЕ / мл, тогда как мутанты dps являются неактивными (данные не показаны).

    РИС. 7.

    Температурное напряжение. Ночные культуры клеток дикого типа (WT) или dps инкубировали при 55 ° C. Звездочки указывают на отсутствие обнаруживаемых клеток (предел обнаружения <1000 КОЕ / мл). Показаны репрезентативные данные.

    Учитывая повышенную чувствительность мутантов dps к тепловому стрессу, мы определили, играет ли Dps роль в тепловой адаптации.Термическая адаптация — это явление, при котором клетки, первоначально подвергшиеся воздействию повышенной сублетальной температуры, становятся устойчивыми к более высоким температурам, которые обычно являются летальными (16, 23, 24). Чтобы наблюдать Dps-специфические эффекты на тепловую адаптацию, клетки стационарной фазы как мутантных, так и штаммов дикого типа предварительно обрабатывали при 53 ° C в течение 10 минут с последующей инкубацией при 55 ° C. dps Титры мутантных клеток упали до 10 6 КОЕ / мл в течение 15 минут при 55 ° C, тогда как клетки дикого типа, по-видимому, претерпели тепловую адаптацию, оставаясь на уровне 10 9 КОЕ / мл.Титры клеток дикого типа остаются высокими в течение 30 мин (данные не показаны).

    Подобные эксперименты по выживанию были проведены для холодового шока. Культуры стационарной фазы как дикого типа, так и мутантных клеток dps переводили на 4 или 18 ° C. Не наблюдалось различий в жизнеспособности клеток между штаммами дикого типа и мутантными штаммами после 2 ч инкубации при любой температуре или после 10 дней инкубации при 4 ° C (данные не показаны).

    dps мутанты чувствительны к щелочному и кислому pH.PH культур стационарной фазы дикого типа или dps мутантных клеток изменяли в диапазоне от 2 до 12 добавлением HCl или NaOH соответственно. В условиях кислотного стресса мутанты dps демонстрируют в 100 раз большую чувствительность после 30 минут при pH 2 и 10 4 — в раз большую чувствительность после 60 минут воздействия, когда мутанты становятся необнаруживаемыми (рис. ). Клеткам дикого типа требуется в два раза больше времени, чтобы полностью потерять жизнеспособность.

    РИС. 8.

    pH-стресс.Ночные культуры клеток дикого типа (сплошные символы) или dps (светлые символы) инкубировали при pH 7 (квадраты), 2 (кружки) или 12 (треугольники). Звездочки указывают на отсутствие обнаруживаемых клеток (предел обнаружения <1000 КОЕ / мл). Показаны репрезентативные данные.

    В щелочных условиях (pH 12) dps мутанты мгновенно теряют жизнеспособность при добавлении NaOH (рис. 8). Хотя клетки дикого типа показывают немедленное 100-кратное снижение титра клеток, этим клеткам требуется 30 минут, чтобы полностью потерять жизнеспособность.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Мы идентифицировали гомологи Dps у более чем 130 видов бактерий и одного члена архей, представляющих широкий спектр прокариотических организмов (S. Nair и S. E. Finkel, неопубликованные данные). Распространенность среди видов, высокая численность, ДНК-связывающая активность и защитные функции Dps привели нас к изучению роли этого белка в долгосрочном выживании в стационарной фазе. Это исследование показывает, что клетки, экспрессирующие Dps, способны выдерживать многие стрессы окружающей среды в большей степени, чем мутанты dps .Существует ряд механизмов, с помощью которых Dps может защищать клетки от этих стрессов, основанных на четырех внутренних свойствах белка: связывании ДНК, связывании с металлами и секвестрации, активности ферроксидазы и способности влиять на регуляцию генов. Каждый из них обсуждается ниже.

    Мономеры Dps собираются в додекамерную функциональную единицу, и эти додекамеры упаковывают (как апельсины, сложенные в ящик) с ДНК в трехмерную гексагональную структуру (10, 11, 16, 24). В биокристалле положительно заряженный остов ДНК, скорее всего, взаимодействует с Dps через основные остатки на поверхности додекамеров (13).Во время стационарной фазы Dps конденсирует хромосому так, что большинство других макромолекул исключаются. Путем прямого связывания хромосомы Dps может защищать ДНК от повреждений, вызванных пероксидами и другими агентами. Эта модель подтверждается исследованиями, показывающими, что Dps защищает плазмидную ДНК от атаки пероксида и ДНКазы I (12). Защита от гамма-излучения, обеспечиваемая ДНК с помощью HU, другого бактериального гистоноподобного белка, аналогична защите с помощью Dps, показанной здесь (6). Мутанты HU в пять раз более чувствительны к гамма-излучению, чем клетки дикого типа.Мы предполагаем, что Dps защищает ДНК от УФ- и гамма-излучения по механизму, аналогичному HU: предотвращение одно- и двухцепочечных разрывов, связанных с облучением. Он также может служить в качестве конкурентного субстрата для окислительных радикалов, генерируемых различными растворителями, металлами и излучением.

    Также возможно, что Dps увеличивает эффективность и точность процесса репарации за счет привлечения ферментов репарации или других белков к хромосоме. Например, Dps может модулировать взаимодействия с белками, участвующими в поддержании суперспирального состояния ДНК.Поскольку, как показано здесь, мутанты dps чувствительны к температуре, образуя связанный с ДНК биокристалл, Dps может предотвращать релаксацию ДНК во время теплового шока (1). Это может быть похоже на наблюдаемые взаимодействия между DnaK и ДНК-гиразой. Во время теплового шока шаперон DnaK связывается с хромосомой, способствуя активности ДНК-гиразы (20). Будет интересно определить, взаимодействует ли Dps аналогичным образом с какими-либо такими белками.

    Мы также можем видеть сходство между активностью Dps и белков SASP (малые растворимые в кислоте) спор Bacillus subtilis (25).Белки SASP неспецифически связываются с ДНК и изменяют ее конформацию с формы B на форму A. Во время УФ-облучения белки SASP предотвращают образование фотопродуктов бипиримидина, таких как фотодимер Т-Т. Вместо этого образуются фотопродукты, называемые повреждениями SP, которые восстанавливаются с помощью специфической для спор системы репарации (22). Белки SASP также изменяют химическую реактивность ДНК во время теплового стресса, замедляя скорость депуринизации. Dps, образуя биокристалл, может аналогичным образом изменять реактивность ДНК, так что она становится менее чувствительной к тепловому стрессу и УФ-облучению.Будет полезно определить конформацию ДНК, связанной с Dps, и сравнить относительное количество сайтов депуринизации после теплового стресса у штаммов дикого типа и dps нулевых штаммов.

    Dps является структурным гомологом ферритина, основного белка-хранилища железа практически всех организмов (13, 14). Функционально ферритины определяются способностью связывать железо и наличием активности ферроксидазы. Основное различие между Dps и ферритинами заключается в том, что Dps связывает ДНК.Мономеры Dps и ферритина имеют одинаковую третичную структуру из четырех спиралей и пучков и образуют мультибелковые сферы с полыми ядрами, функционирующие как 12-меры и 24-меры, соответственно. В обеих мультимерных сферах три субъединицы мономера образуют тримеры (четыре в Dps и восемь для ферритинов) с порами диаметром ∼20 Å. Эти поры выстланы кислотными остатками, которые могут принимать положительно заряженные ионы, такие как железо (13). Гомологи Dps у других организмов, таких как Dps из Listeria innocua (7) и DpsA из Halobacterium salinarium (22), также оказались ферритинами.DpsA из Synechococcus представляет собой бактериоферритин, так как он содержит гемовый фрагмент (21). Недавно было показано, что Dps действует как запасной белок железа, участвуя в его связывании, окислении и минерализации (15). Каждый додекамер может вместить ~ 500 атомов железа. Хелатирование металлов защищает организмы от нападения различных химически активных металлов, включая Fe (II), который участвует в реакции Фентона: Fe 2+ + H 2 O 2 → Fe 3+ + OH — + ОЙ.В результате этой реакции образуются гидроксильные радикалы, которые могут повредить макромолекулы, включая белки, мембранные липиды и ДНК. В ферритинах Fe (II) окисляется в центре ферроксидазы, выпадает в осадок в виде нерастворимого оксигидроксида железа, Fe (III), и сохраняется в полой сердцевине белка. Следующая реакция суммирует реакции, которые происходят во время окисления и минерализации железа, когда окислителем является кислород (14): 4Fe 2+ + O 2 + 6H 2 O → 4FeOOH + 8H + .Напротив, окисление железа Dps происходит медленно, когда окислителем является O 2 . Однако в присутствии перекиси водорода окисление и минерализация железа происходят быстро (29). Скорость окисления более чем в 100 раз выше в присутствии H 2 O 2 , чем O 2 . Это различие может быть связано с разными аминокислотами, образующими активный центр ферроксидазы, по сравнению с аминокислотами для ферритинов (13, 15). Dps не имеет консервативных остатков, связанных с ферроксидазным центром семейства ферритина.Ферроксидаза Dps потребляет H 2 O 2 двумя способами, как для окисления, так и для минерализации (29), что суммируется реакцией 2Fe 2+ + H 2 O 2 + 2H 2 O → 2FeOOH + 4H + . В этой реакции Fe (II) окисляется до Fe (III) с помощью H 2 O 2 , и окисленный Fe (III) минерализуется в ядре в виде нерастворимого оксогидроксида железа (III) в ядре додекамера (29). . Одна молекула H 2 O 2 расходуется на каждые две молекулы окисленного Fe (II).

    Таким образом, окисляя и минерализуя железо, Dps служит двум целям: (i) оба процесса приводят к гашению H 2 O 2 и предотвращают его взаимодействие с двухвалентным железом в реакции Фентона и (ii) через минерализацию, Fe (III) хранится в ядре Dps. Захваченное железо изолируется из цитозоля, восстановительной среды, которая может преобразовать его обратно в реактивное Fe 2+ . Это предотвращает его взаимодействие с H 2 O 2 , образующимся в ходе различных метаболических процессов.Также было показано, что Dps обладает слабой каталазной активностью, дополнительно нейтрализуя перекись водорода (29). Это приводит к превращению двух потенциально вредных реагентов в безвредные продукты.

    Dps, как известно, влияет на экспрессию генов как положительно, так и отрицательно. При проведении двумерного гель-электрофореза клеточных экстрактов, полученных из клеток дикого типа и мутантных клеток dps , наблюдаются различия в структуре белковых пятен (2). Некоторые пятна присутствуют в клетках дикого типа, но не в мутанте, и наоборот.Во время длительной инкубации в стационарной фазе (до 10 дней) наблюдалась дифференциальная экспрессия белка (S. E. Finkel и R. Kolter, неопубликованные результаты). У эукариот гистоны подвергаются обратимым ковалентным модификациям, чтобы сделать ДНК доступной или недоступной для транскрипционного аппарата, тем самым регулируя экспрессию генов (4). Будет интересно определить, играет ли Dps аналогичную роль в дифференциальной экспрессии генов, подвергаясь ковалентным модификациям. Dps может регулировать экспрессию генов как за счет модуляции структуры ДНК, так и за счет взаимодействия с аппаратом транскрипции, возможно рекрутируя факторы транскрипции.Также представляет интерес сравнение паттернов экспрессии генов в различных стрессовых условиях, таких как описанные здесь.

    Присутствие гомологов Dps в большом количестве организмов, хотя и с функциональной дивергенцией, предполагает их важность для выживания при стрессе во многих средах. У большинства организмов это, вероятно, ДНК-связывающий белок, который защищает организм от различных стрессов. Однако у некоторых патогенных организмов, таких как Treponema pallidum и Haemophilus ducreyi , это основная детерминанта вирулентности, необходимая для патогенности (5, 8, 11).Исследования бактерий стационарной фазы могут служить лучшим приближением к естественной среде обитания этих организмов, и такие исследования помогут нам лучше понять бесчисленное множество ролей этого очень распространенного белка.

    БЛАГОДАРНОСТИ

    Мы благодарим Майкла Фаррелла, Вячеслава Пальчевского, Эвана Пеппера, Джули Бэджер, Джорджа О’Тула и Дайан Ньюман за полезные обсуждения и комментарии к рукописи. Мы благодарим Памелу Конрад за помощь в проведении экспериментов по гамма-облучению.

    Эта работа была частично поддержана Комплексным онкологическим центром USC / Norris и Фондом В. М. Кека.

    СНОСКИ

      • Получено 2 декабря 2003 г.
      • Принято 26 марта 2004 г.
    • Авторские права © 2004 Американское общество микробиологии

    СПРАВОЧНИКИ

    1. 3, Адам , Дж. Вигласки, Ф. Валле, М. Анталик, Д. Подградский, Г. Дитлер. 2002. Влияние температуры роста бактерий на распределение суперспиральной ДНК и ее термическую стабильность.Электрофорез 23 : 3300-3309.

    2. 2.↵

      Альмирон, М., А. Дж. Линк, Д. Ферлонг и Р. Колтер. 1992. Новый ДНК-связывающий белок с регуляторной и защитной ролью в голодной Escherichia coli . Genes Dev. 6 : 2646-2654.

    3. 3.↵

      Altuvia, S., M. Almiron, G. Huisman, R. Kolter, and G. Storz. 1994. Промотор dps активируется OxyR во время роста и IHF и сигма S в стационарной фазе.Мол. Microbiol. 13 : 265-272.

    4. 4.↵

      Berger, S. L. 1999. Активация генов гистоновыми и факторными ацетилтрансферазами. Curr. Мнение. Cell Biol. 11 : 336-341.

    5. 5.↵

      Боренштейн, Л. А., Дж. Д. Радольф, Т. Е. Фенигер, Д. Р. Бланко, Дж. Н. Миллер и М. А. Ловетт. 1988 г. Иммунизация кроликов рекомбинантным поверхностным антигеном Treponema pallidum 4D изменяет течение экспериментального сифилиса.J. Immunol. 140 : 2415-2421.

    6. 6.↵

      Boubrik, F., and J. Rouviere-Yaniv. 1995. Повышенная чувствительность к гамма-облучению у бактерий, лишенных белка HU. Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки 92 : 3958-3962.

    7. 7.↵

      Боззи, М., Дж. Миньогна, С. Стефанини, Д. Барра, К. Лонги, П. Валенти и Э. Кьянконе. 1997. Новый негемовый железосвязывающий ферритин, родственный ДНК-связывающим белкам семейства Dps в Listeria innocua .J. Biol. Chem. 272 : 3259-3265.

    8. 8.↵

      Брентьенс, Р. Дж., М. Кеттерер, М. А. Апичелла и С. М. Спинола. 1996. Тонкие спутанные пили, экспрессируемые Haemophilus ducreyi , представляют собой новый класс пилей. J. Bacteriol. 178 : 808-816.

    9. 9.↵

      Буда, Ф., Б. Энсинг, М. К. Грибнау, Э. Дж. Бэрендс. 2003. O 2 эволюция в реакции Фентона. Химия 9 : 3436-3444.

    10. 10.

      Byun, M. W., O. J. Kwon, H. S. Yook и K. S. Kim. 1998. Гамма-облучение и обработка озоном для инактивации Escherichia coli O157: H7 в питательных средах. J. Food Prot. 61 : 728-730.

    11. 11.↵

      Fehniger, T. E., J. D. Radolf и M. A. Lovett. 1986. Свойства упорядоченной кольцевой структуры, образованной рекомбинантным поверхностным антигеном Treponema pallidum 4D.J. Bacteriol. 165 : 732-739.

    12. 12.↵

      Френкиль-Криспин, Д., С. Левин-Зайдман, Э. Шимони, С. Г. Вольф, Э. Дж. Вахтель, Т. Арад, С. Е. Финкель, Р. Колтер и А. Мински. 2001. Регулируемые фазовые переходы бактериального хроматина: неферментативный путь для общей защиты ДНК. EMBO J. 20 : 1184-1191.

    13. 13.

      Грант Р. А., Д. Дж. Филман, С. Е. Финкель, Р. Колтер и Дж. М. Хогл. 1998 г.Кристаллическая структура Dps, гомолога ферритина, который связывает и защищает ДНК. Nat. Struct. Биол. 5 : 294-303.

    14. 14.↵

      Харрисон, П. М. и П. Арозио. 1996. Ферритины: молекулярные свойства, функция хранения железа и клеточная регуляция. Биохим. Биофиз. Acta 1275 : 161-203.

    15. 15.↵

      Илари, А., П. Чечи, Д. Феррари, Г. Л. Росси и Э. Чианконе. 2002. Включение железа в Escherichia coli Dps дает ферритиноподобное микрокристаллическое ядро.J. Biol. Chem. 277 : 37619-37623.

    16. 16. ↵

      Дженкинс Д. Э., Дж. Э. Шульц и А. Матин. 1988. Вызванная голодом перекрестная защита от тепла или заражения H 2 O 2 в Escherichia coli . J. Bacteriol. 170 : 3910-3914.

    17. 17.↵

      Leforestier, A., and F. Livolant. 1993. Супрамолекулярное упорядочение ДНК в холестерической жидкокристаллической фазе: ультраструктурное исследование.Биофиз. Дж. 65 : 56-72.

    18. 18.↵

      Martinez, A., and R. Kolter. 1997. Защита ДНК во время окислительного стресса с помощью неспецифического ДНК-связывающего белка Dps. J. Bacteriol. 179 : 5188-5194.

    19. 19.↵

      Мински, А., Э. Шимони и Д. Френкиль-Криспин. 2002. Стресс, порядок и выживание. Nat. Преподобный Мол. Cell Biol. 3 : 50-60.

    20. 20.↵

      Огата, Ю., Т. Мидзусима, К. Катаока, К. Кита, Т. Мики и К. Секимидзу. 1996. Белок теплового шока DnaK Escherichia coli поддерживает отрицательную суперспирализацию ДНК против теплового стресса. J. Biol. Chem. 271 : 29407-29414.

    21. 21.↵

      Pena, M. M., and G. S. Bullerjahn. 1995. Белок DpsA Synechococcus sp. штамм PCC7942 представляет собой ДНК-связывающий гемопротеин. Связывание семейств белков Dps и бактериоферритина.J. Biol. Chem. 270 : 22478-22482.

    22. 22.↵

      Рейндель, С., С. Анемюллер, А. Саварин и Б. Ф. Мацанке. 2002. DpsA-гомолог архея Halobacterium salinarum — ферритин. Биохим. Биофиз. Acta. 1598 : 140-146.

    23. 23.↵

      Риле, М. М., А. Ф. Беннетт и А. Д. Лонг. 2001. Генетическая архитектура термической адаптации у Escherichia coli .Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки 98 : 525-530.

    24. 24.↵

      Schultz, J. E., G. I. Latter и A. Matin. 1988. Дифференциальная регуляция циклическим АМФ синтеза белка голодания в Escherichia coli . J. Bacteriol. 170 : 3903-3909.

    25. 25.↵

      Setlow, P. 1995. Механизмы предотвращения повреждения ДНК в спорах видов Bacillus . Анну. Rev. Microbiol.49 : 29-54.

    26. 26.↵

      Stadtman, E. R., and B. S. Berlett. 1991. Химия Фентона. Окисление аминокислот. J. Biol. Chem. 266 : 17201-17211.

    27. 27.↵

      Вольф, С. Г., Д. Френкиль, Т. Арад, С. Е. Финкель, Р. Колтер и А. Мински. 1999. Защита ДНК путем биокристаллизации, вызванной стрессом. Природа 400 : 83-85.

    28. 28.↵

      Замбрано, М.М., Д. А. Зигеле, М. Альмирон, А. Тормо и Р. Колтер. 1993. Микробная конкуренция: мутантов Escherichia coli , которые захватывают культуры стационарной фазы. Наука 259 : 1757-1760 гг.

    29. 29.↵

      Zhao, G., P. Ceci, A. Ilari, L. Giangiacomo, T. M. Laue, E. Chiancone и N. D. Chasteen. 2002. Детоксикационные свойства ДНК-связывающего белка из голодных клеток железом и перекисью водорода. Ферритин-подобный ДНК-связывающий белок Escherichia coli .J. Biol. Chem. 277 : 27689-27696.

    2018-2019 DPS Alchemist Wailer 106 — BLISTER

    DPS Alchemist Wailer 106

    Лыжи: 2018-2019 DPS Alchemist Wailer 106, 189 см

    Доступная длина: 168, 178, 185, 189 см

    Измеренная длина блистера от кончика до хвоста: 190,0 см

    Заявленный вес каждой лыжи: 2005 г

    Измеренный вес блистера на лыжи: 1923 и 1956 граммов

    Заявленные размеры: 137-106-125 мм

    Измеренные размеры блистера: 142.2-106,5-128,7 мм

    Заявленный радиус бокового выреза: 18 метров

    Tip & Tail Splay (лыжи без косточек): 56 мм / 27 мм

    Традиционный изгиб под стопой: ~ 2 мм

    Сердечник: Ламинат из углеродного волокна Aspen + Prepreg

    Рекомендуемая заводом точка крепления: -10,4 см от центра; 84,6 см от хвоста

    Рекомендуемая точка крепления блистера: -10,4 см от центра

    Ботинки / крепления: Lange RX 130 / Tyrolia AAAttack2 13

    Место проведения: Алеевская, АК

    дней на лыжах: 25

    [ Примечание : Наш обзор проводился на 17/18 Alchemist Wailer 106, который не был изменен на 18/19, за исключением графики.]

    Введение

    Теперь мы протестировали новую конструкцию DPS «Алхимик» как на Alchemist Wailer 112, так и на Alchemist Lotus 124 и пришли к выводу, что она является хорошим улучшением по сравнению с предыдущими конструкциями из карбона от DPS.

    Так что насчет нового Alchemist Wailer 106? Вот что говорит об этом DPS (и они могут многое сказать об этом):

    «Форма Wailer A106 представляет собой прекрасное место в колчане любого лыжника, а укладка Alchemist делает его намного более прочным в смешанных условиях, в которых он предназначен для процветания.Он легкий и готов к путешествию, но при этом требует ежедневной интенсивной езды на курорте или по канатам. Регулярно обращайтесь к нему в подходящих условиях и испытайте новый подход шасси к конструкции бокового выреза и гибкого профиля. Это лыжи, которые огибают ваш ботинок, умоляя вас изменять радиусы ваших дуг, когда вы прорезаете или едете по разнообразному снегу и местности ».

    Это описание стоит изучить построчно, так что давайте:

    Форма Wailer A106 представляет собой прекрасное место в колчане любого лыжника, а укладка Alchemist делает его намного более сильным в смешанных условиях, в которых он создан для процветания.

    Хорошо, значит, эта версия должна работать лучше в изменчивых условиях, чем предыдущие «чистые» углеродные Wailers, и она не должна просто работать лучше, она «предназначена для процветания» в них. Учитывая следующее заявление:

    , это довольно серьезное утверждение.

    Это легкий и готовый к поездке…

    Это определенно верно; наша пара весит значительно меньше 2000 г на лыжи, и это при длине 189 см. Это свет, особенно для лыж, которые предположительно…

    просит, чтобы его ежедневно жестко водили на курорте или под канатами.- чем приличнее. Это совершенно справедливо и разумно, и приятно видеть, что этот квалификатор включен. Используйте эти лыжи в действительно хороших условиях или в мягких (э) переменных условиях.

    Но теперь нам нужно внимательно изучить следующую часть:

    … испытайте новый подход шасси к конструкции бокового выреза и гибкого профиля. Это лыжи, которые огибают ваш ботинок, умоляя вас изменять радиус ваших дуг, когда вы прорезаете или едете по разнообразному снегу и местности.

    Узор изгиба / «изгибается вокруг ботинка»

    Будет очень интересно посмотреть, заметим ли мы, что эти лыжи «огибают наши ботинки» больше, чем другие лыжи, или «умоляют нас модулировать радиусы наших дуг» больше, чем другие лыжи, потому что факт в том, что Рисунок изгиба 189 Alchemist Wailer 106 довольно жесткий, особенно через заднюю половину лыжи, и мы обычно ожидаем более мягкого рисунка изгиба от лыж, которые, как говорят, предназначены для сгибания вокруг ваших ботинок.

    Рука сгибает лыжи, мы бы разбили это так:

    Наконечники: 7-7,5
    Лопаты: 7,5-8
    Перед пяткой: 9-10
    Под стопой: 10
    За задником: 9
    Хвосты: 9-9,5

    В качестве ориентира этот рисунок изгиба сопоставим с рисунком изгиба (гораздо более тяжелого) 185-сантиметрового Blizzard Cochise, но Wailer A106 на самом деле немного жестче в хвостовой части.

    И помните, как мы говорили об самой «игре» о Faction Dictator 3.0? Что ж, хвосты Wailer A106 практически неотличимы от Dictator 3.0, и, во всяком случае, Wailer 106 немного жестче в самом конце.

    Кому-то из вас это может показаться очень странным, но это правда — задняя часть этих лыж массивная. То же самое мы сказали и о задней половине 189-сантиметровых лыж DPS Alchemist Wailer 112, которые часто воспринимаются как своего рода пудра. Но это просто неправда, так что, возможно, пора освежить впечатления от некоторых из этих лыж.

    Примечание / предостережение относительно Flex Pattern

    Будучи настолько удивлены тем, насколько жесткими являются 189 см Alchemist Wailer 106 и 189 см Wailer 112 flex, мы специально спросили DPS, делают ли они жестче свои лыжи при более длинной длине, и ответ, кажется, да. Вот что они сказали:

    «» Каждая длина наших лыж, независимо от модели, разработана специально для этой длины. Наши инженеры понимают, что гибкость и форму необходимо решать индивидуально, чтобы каждая лыжа работала наилучшим образом.”

    Дело в том, что мы не думаем, что здесь безопасно делать какие-либо обобщения о жесткости этих лыж при их меньшей длине. Но у нас также не было возможности согнуть эти лыжи на их более коротких длинах. Но большая длина этих лыж жесткая.

    Конечно, жесткая гибкость — это ни в коем случае не плохо, и мы увидим, насколько хорошо сочетаются узор гибкости, вес и форма Wailer A106.

    Подробнее о весе / некоторые сравнения

    На ваше рассмотрение, вот несколько лыж, которые, по нашему мнению, должны быть предметом разговора с Alchemist Wailer 106, учитывая их вес и / или форму гибкости и / или предназначение в качестве лыж типа 50-50 / колчан для одной лыжи.

    DPS Alchemist Wailer 106, 189 см

    Faction Dictator 3.0, 186 см

    Black Diamond Boundary Pro 107, 184 см

    16/17 Rossignol Soul 7, 188 см

    Salomon QST 106, 188 см

    Головка Kore 105, 189 см

    • (предостережение в том, что HEAD увеличил вес Kore 105 примерно до 2035 г на лыжи)

    Line Sick Day 104, 186 см

    Atomic Backland FR 109, 189 см

    ДПС Фантом

    Еще одна очень примечательная особенность нашей тестовой пары Wailer A106 заключается в том, что на эти лыжи нанесено покрытие DPS Phantom Base Glide.Это будет наш первый тест Phantom (хотя в этом сезоне мы будем использовать еще несколько лыж и использовать Phantom), поэтому в дополнение к характеристикам Wailer A106 мы начнем знакомить с нашими впечатлениями на снегу. с Phantom тоже.

    Итог (на данный момент)

    Будет очень интересно посмотреть, насколько хорошо Alchemist Wailer 106 работает во всех этих различных приложениях (гастроли, заезды, 50/50) и в целом ряде условий.

    Следите за обновлениями и дайте нам знать, какие вопросы вы хотели бы увидеть в нашем полном обзоре.

    ДАЛЕЕ: Полный обзор

    36 Публикации Bioinfo ФУНКЦИИ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА DPS КАК ГЛОБАЛЬНЫЙ РЕГУЛЯТОР ПРИ ГОЛОДЕ SALMONELLA ENTERICA SEROVAR ENTERITIDIS ВО ВРЕМЯ ГОЛОДА

    ДНК-связывающий белок Dps функционирует как глобальный регулятор в голодной MicroSalmonella enterica

    serovar

    Исследования

    ISSN: 0975-5276 и E-ISSN: 0975–9174, Vol.3, Issue 3, 2011

    Устойчивость голодающих S. enteritidis. Мы задались целью определить

    , чтобы определить, были ли гены, которые мы идентифицировали как

    регулируемые (прямо или косвенно) Dps, также

    важными для устойчивости к пероксиду водорода, железу и кислоте

    .

    Стресс-анализы проводили, как описано в разделе экспериментальных процедур

    . Вкратце, голодные культуры S.

    enteritidis ∆dps, ∆STM0410, ∆ galR, ∆STY4154 и

    дикого типа подвергали воздействию 20 мМ h3O2, 100 мМ

    FeSO4 и pH 2.0 в течение одного часа. При воздействии

    h3O2 родительский штамм продемонстрировал значительный уровень устойчивости

    с процентом выживания 86% через 20

    минут и 20% через один час. Напротив, все четыре мутантных штамма

    были сверхчувствительны к перекиси водорода

    по сравнению с родительским S. enteritidis (рис. 2а). Мутанты с делециями

    STM0410, galR и STY4154

    работали немного лучше, чем мутант dps через 20

    минут, но показали аналогичную выживаемость через 40 минут воздействия

    .За исключением S. enteritidis

    ΔSTM0410 (который имел процент выживания 64%),

    -процентная выживаемость каждого мутанта упала ниже пятидесяти

    процентов в течение 20 минут после воздействия. Однако после одного часа воздействия

    все мутантные культуры были полностью убиты на

    , за исключением мутанта с делецией STM0410, у которого

    один процент культуры оставался жизнеспособным.

    Анализы стресса на железо и кислоту дали результаты

    , сравнимые с результатами анализа стресса пероксида водорода

    .В этих анализах делеционные мутанты также на

    были более восприимчивы к вышеупомянутым стрессам, чем

    дикого типа. При воздействии 100 мМ FeSO4 мутанты

    STM0410, galR и STY4154 показали

    , аналогичные мутантам dps через 20, 40 и 60 минут

    (рисунок 2b). Менее 45% всех мутантов

    оставались жизнеспособными после 20 минут воздействия FeSO4, в то время как 88% из

    культуры дикого типа оставались в этот момент времени.После 60

    минут воздействия FeSO4 менее 1% каждой мутантной культуры

    оставалось жизнеспособным, в то время как почти 15% родительской культуры

    оставалось жизнеспособным. Все исследованные делеционные мутанты

    также были гиперчувствительны к кислотному стрессу

    (рис. 2c). За исключением мутантной культуры

    с делецией STM0410 (которая имела процент выживания 44%)

    , менее 30% всех мутантов оставались жизнеспособными после 20

    минут воздействия pH 2.0. В этот момент процент выживания родительского штамма

    составлял 69%. Мутант

    STM0410 был немного менее чувствителен к экстремальной кислотности

    , чем мутанты STY4154, dps и galR. Через

    40 минут этот мутант показал выживаемость, аналогичную

    дикого типа (17% и 23% соответственно). Как и в анализе чувствительности

    h3O2, кислотоустойчивый фенотип мутанта STM0410

    оказался между фенотипом

    дикого типа и мутантом dps.Тем не менее, кислотная устойчивость

    , наблюдаемая у мутанта STY4154 и мутанта galR

    , была очень похожа на ту, которая наблюдалась у мутанта dps.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Регуляторная роль ферритин-подобного белка Dps была

    , исследованная здесь впервые с использованием аналитических методов

    , разработанных для мониторинга изменений в экспрессии гена

    . Возможность регуляторной функции для

    Dps была первоначально предложена [1] из-за плейотрофного фенотипа

    E.coli dps (в отношении экспрессии белка

    ), выявленного с помощью 2D-гель-электрофореза. Для выяснения этой функции мы провели мониторинг экспрессии гена

    в S. enteritidis dps, используя углубленный генетический анализ экспрессии

    , чтобы установить конкретные доказательства регуляторной роли

    Dps. Скрининг микрочипов, проведенный в этой работе

    , выявил дифференциальную экспрессию

    сотен функционально различных генов у голодных S.

    enteritidis dps. Кроме того, мы смогли показать, что

    предполагаемых регуляторов, кодируемых из STM0410 и

    ,

    STY4154 и белок-репрессор галактозы galR, действительно,

    недоэкспрессируются в голодных S. enteritidis dps.

    В совокупности эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что Dps

    функционирует как глобальный регулятор у S. enteritidis в условиях дефицита питательных веществ

    и что белок

    положительно регулирует экспрессию galR, STM0410,

    ,

    и STY4154 в указанных условиях.Хотя наши результаты

    указывают на регуляторную роль Dps, мы не выяснили, регулирует ли Dps прямо или косвенно

    вышеупомянутые гены-мишени в данном конкретном исследовании.

    Прямая регуляция мишеней с помощью Dps будет означать, что белок

    способен распознавать специфические последовательности ДНК или промоторы

    и связываться соответственно. Такой регуляторный феномен

    лучше всего будет доказать с помощью анализа связывания ДНК in vitro

    с использованием специфических последовательностей ДНК

    или промоторов в качестве мишеней связывания и очищенного белка Dps

    .

    Однако известным связывающим свойством Dps, жизненно важным для его способности

    изолировать и защищать хромосомную ДНК

    во время стресса, является его способность связывать ДНК независимым образом в последовательности

    . Dps может обладать способностью связывать

    со специфичностью последовательности в зависимости от природы его активности

    , т.е. Dps может распознавать ДНК со специфичностью последовательности

    , когда функционирует в регуляторной способности, и

    неспецифично, когда действует как секвестрирующая и

    защитное средство.Как упоминалось ранее, Dps

    был помечен как гистоноподобный белок из-за его

    сходства с эукариотическим гистоном. Эти белки

    , как известно, различимо действуют в различных физиологических условиях

    в отношении регуляции генов

    [10-11]. Такое различительное распознавание ДНК составляет

    , поэтому правдоподобно для Dps, поскольку нет прямых доказательств

    того, что Dps неспособен связывать ДНК в последовательности

    специфическим образом при определенных обстоятельствах.

    В процессе выяснения регуляторной роли Dps,

    мы определили galR как важный элемент для индукции устойчивости

    у голодающих S. enteritidis;

    особенно стойкость к перекиси водорода, железу и кислоте

    . Продуктом гена galR является ДНК-связывающий регулятор транскрипции

    оперона галактозы GalR.

    Этот генетический репрессор является членом семейства LacI / GalR

    ; семейство, состоящее из

    многочисленных регуляторов транскрипции, участвующих в регуляции метаболизма.Экспрессия galR

    контролируется (по крайней мере частично) Dps

    у голодающих S. enteritidis (как показано в этом исследовании).

    Однако экспрессия galR контролируется глобальным регулятором

    , RegR у Streptococcus pneumonia [16].

    RegR важен для адаптивного ответа

    Streptococcus pneumonia и служит регулятором вирулентности

    в этом организме [16]. Эти напряжения и

    F.Deblauwe: Пространственный анализ Мелебия

    Ф. Деблаув: Пространственный анализ Мелебия

    Пространство говорит Объемы:


    Количественная оценка пространственных характеристик 3-го тысячелетия до н. Э. Дома
    в Телль Мелебия, Сирия

    Фрэнсис Деблаув (Университет Миссури-Канзас-Сити)

    Текст
    Примечания в конце
    Рисунки
    Как связаться с автором

    С 1984 по 1988 гг. Команда археологов под руководством доктора Ф.Марк Лебо раскопал Телль Мелебия (1). Это место находится на реке Хабур, немного южнее Хассаке, на северо-востоке Сирии. Раскопки этого провинциального города относятся к эпохе раннего династии III и средневековью Айюбидов. В этой статье я сосредоточусь на домах периода ранней династии III (ок. 2500-2300 до н. Э.) В их заключительной фазе. Меня особенно интересуют пространственные характеристики этих зданий и их отношение к функциям помещений и категориям зданий (2).

    Во-первых, я проанализировал схемы обращения и доступа к планам этажей, как указано в окончательном отчете. Как получить доступ к разным пространствам здания, как они связаны и каково их место в комплексе в целом? Когда кто-то строит здание, он делает выбор, сознательный или бессознательный. Проход через определенные комнаты и доступ к ним может быть затруднен или легок. Следовательно, определенная иерархия очевидна в распределении и соотношении пространств, содержащихся в здании.Само здание также может быть более или менее интегрированным.

    Первый набор переменных был получен путем анализа реальной относительной асимметрии. Это метод, разработанный Биллом Хиллиером, который позволяет количественно оценить, насколько хорошо связаны различные пространства в здании (3). Давайте посмотрим на рисунок 1. Сначала рисуем обоснованную схему здания, прослеживая переход от одного помещения (кухня, двор и т. Д.) К другому, начиная с внешней стороны, это «снаружи», из которого один входит в здание.Внешний вид обозначен кружком с крестом внутри, а остальные пространства представлены простыми кружками. Аттестованные дверные проемы обозначены сплошной линией, соединяющей места; реконструированы дверные проемы по ломаной линии.

    На рисунке 3 мы видим второй этап: вычисление параметра относительной асимметрии. Наименьшее возможное количество шагов для перехода от каждого пространства к любому другому пространству (включая внешнее) записывается, и сумма рассчитывается для каждого пространства. Следующая строка содержит значения средней глубины на пробел.Все формулы пространственного анализа приведены на рисунке 5. Затем вычисляется относительная асимметрия. Чем меньше значение этого параметра, тем лучше пространство конструктивно интегрировано в здание или, другими словами, тем легче к нему добраться. Однако, чтобы иметь возможность сравнивать разные здания с разным количеством помещений, нам необходимо вычислить реальную относительную асимметрию или RRA. Это по-прежнему оставляет нам значения только для отдельных пространств, хотя мы, естественно, хотели бы сравнивать и целые здания.Это легко сделать, рассчитав среднее значение RRA.

    Вернемся к воображаемому примеру. Обратите внимание на рисунках 2 и 4, как значение RRA для пространства 2 и средний RRA увеличиваются, когда один блокирует дверной проем между пространствами 1 и 2. Более высокое значение RRA означает меньшую доступность, более низкое значение RRA означает более высокую доступность. Планы этажей наиболее полных домов Телль Мелебия и схемы циркуляции, основанные на понимании их доктором Лебо, показаны на рисунке 7.Я рассчитал параметры RRA для отдельных пространств внутри конструкций, а также для домов в целом (здание RRA).

    Однако остается одна проблема: из-за характера этого анализа RRA он может быть надежно выполнен только для зданий, у которых у нас есть хотя бы почти полный план этажа. Поэтому я хотел бы предложить второй способ измерения циркуляции внутри зданий, основанный на дверных проемах на пространство. Можно просто подсчитать, сколько дверных проемов имеет каждое пространство.Затем рассчитывается среднее значение дверных проемов на пространство или DpS для здания в целом.

    В двух воображаемых примерах DpS пространства 2 изменяется с 2 на 1, DpS пространства 1 с 3 до 1, и среднее значение DpS соответственно уменьшается. Чем ниже среднее значение DpS, тем больше контролируется доступ в помещения внутри здания. В случае с домами в Телль Мелебия возникла очевидная проблема, потому что довольно много дверных проемов являются гипотетическими. Поэтому решил дифференцировать параметр DpS.Сначала я подсчитал дверные проемы, для которых у нас есть безошибочные доказательства, и назвал этот параметр определенным DpS. Затем я снова посчитал количество дверных проемов на пространство, но включил дверные проемы, реконструированные экскаватором. Последнее значение просто называется DpS. В обоих случаях я также записал среднее значение для каждого здания.

    Кроме того, мы более подробно рассмотрим некоторые размерные аспекты. Различают четыре типа «промежутков»: ширина двери, самая длинная и самая короткая сторона пространства и площадь поверхности.Ширина двери обозначается как DW, самая длинная сторона — LS, а самая короткая — SS. Площадь поверхности пространства, реконструированная доктором Лебо, сокращенно называется «площадь». Этот подход вдохновлен размерным исследованием, проведенным Роландом Флетчером (4). Чтобы получить только одно значение для каждого помещения, ширина двери усредняется для каждого помещения (средний DW). Также получены общие средние значения для каждого дома.

    Считается, что все эти чисто архитектурные данные указывают на то, что происходило внутри помещений, и могут подчеркивать различия между помещениями и домами.Я соотнес эти значения пространственных переменных с функцией пространств. Возникает закономерность? Например, легко ли добраться до кухни? Более того, вызывает сомнение функция, приписываемая доктором Лебо некоторым пространствам. Я отделил эти пробелы от остальных и рассматривал их как отдельную категорию функций. Я посмотрел на паттерны переменных в соответствии с этими «специальными функциями».

    Я представляю данные в виде прямоугольных диаграмм. Что такое прямоугольные диаграммы с надрезом? Рисунок 9 начинается с воображаемого примера.Не вдаваясь в статистические детали, этот график можно объяснить следующим образом: поле содержит 50% всех значений, линия внутри поля — это медианное значение. Среднее значение — это среднее значение в ранжированном списке значений. Следовательно, это реальное значение, в отличие от среднего, которое является только математическим средним. Выемки доверительного интервала образуют осиновый силуэт с талией посередине.

    Я сделал прямоугольные диаграммы для всех пространственных переменных. На рисунке 9 прямоугольные диаграммы каждой пространственной переменной построены для функций и проблемных пространств.Проблемные места представлены одной вертикальной линией: естественно, у них есть одно значение. На рисунке 8 перечислены сокращения функций. Первый вопрос: адекватно ли дифференцируются функции пространственными переменными? Что касается ценностей АРСП, то мастерские, приемные, жилые помещения и кухни связаны между собой тем, что они менее доступны. Как и следовало ожидать, вход и переходные помещения очень доступны. График дверных проемов на квадратную коробку правильно показывает, что входные пространства и, в меньшей степени, переходные пространства хорошо связаны.Наименее связанными, наиболее уединенными в некотором смысле являются кухни и мастерские. Аналогичную картину представляет некий график DpS. Значения LS показывают, что переходные пространства выделяются: часто это коридоры с очень длинной стороной. Однако различия в переходных пространствах очень значительны: их форма неоднородна. Входные площадки, как правило, довольно маленькие. На самом коротком участке бокса также есть много вариантов для жилых помещений. Входные помещения снова оказываются небольшими по размерам.Что бросается в глаза из среднего участка DW, так это то, что жилые помещения имеют большой разброс по ширине дверей, некоторые из них довольно большие. У входов также есть большие DW, что имеет смысл. С другой стороны, кухням не нужен легкий доступ. Наконец, значения площади показывают, что жилые помещения снова различаются по размеру от маленьких до больших. Кухни, как правило, крошечные, как входные помещения и мастерские.

    Давайте теперь обратим наше внимание на так называемые проблемные пространства, которые также были включены в коробчатые диаграммы как их собственные специальные категории функций с одним членом.Эти места обозначены на планах и схемах АРСП на рисунках 6 и 7.

    Помещение 186 является возможным боковым входом в дом B1, но, вероятно, в основном оно использовалось как мастерская. Его статус мастерской убедительно подтверждается определенной коробчатой ​​диаграммой DpS и поддерживается значениями DpS и SS. Какие существуют доказательства того, что помещение 186 было входом? Это подтверждают только диаграммы площади и LS. Однако значения DpS идеально подходят для использования в жилых помещениях.

    Предполагается, что помещение 955 в том же доме было переходным центральным пространством, которое также частично служило мастерской. Свидетельства того, что это переходное пространство, можно найти лишь немного на ящике среднего DW. Может быть, это скорее мастерская? Похоже, что это тоже не соответствует этому шаблону: только средние значения DW могут подтвердить это. Однако четкой альтернативы нет.

    В доме B1 есть еще одно интересное пространство, которому присвоен номер 1052.Здесь доктор Лебо тоже видит второй вход в дом, но не с улицы или переулка. Тем не менее он почти полностью отказывается от этой функции в пользу роли приемного пространства. Функция входа находит поддержку в определенных коробчатых диаграммах DpS и, в меньшей степени, в коробчатых диаграммах среднего DW. Его роль в качестве приемной получает некоторую поддержку только со стороны значений RRA и LS.

    Обратимся теперь к большому дому B7. У него довольно плохо засвидетельствованная центральная часть: более поздние вторжения стерли много археологической информации.Основные части площадей 1213, 2150 и 2151 полностью реконструированы. Все они обозначены экскаватором как переходные. Пространство 1213 идентифицируется коробчатой ​​диаграммой DpS как переходное пространство с некоторой дополнительной поддержкой определенных значений DpS и LS. Сильная альтернатива не предлагается, хотя есть поддержка функции жилого помещения в бокс-заговорах LS и RRA.

    Переходный характер пространства 2150 поддерживается графиками RRA, DpS и прямоугольной области. Альтернатива коробчатому сюжету DpS: может быть, жилое пространство? Определенные значения DpS для мастерских и кухонь также находятся в том же общем диапазоне.Пространство 2151 идентифицируется как переходное пространство на определенных графиках DpS и прямоугольных областей. Коробочная диаграмма RRA отчасти это подтверждает. Наконец, помещение 2511 в доме G1 считается переходным, но, похоже, в нем также есть кухня. Только определенные значения DpS и среднего DW поддерживают переходный аспект. Другой роли кухни противоречат коробчатые сюжеты. Хлебная печь или таннур, очевидно, находится в пространстве, которое не имеет пространственных характеристик кухни.

    Мы можем получить дополнительную информацию о так называемых проблемных пространствах и другим способом. Только две пространственные переменные имеют значение для каждого пространства: определенный DpS и площадь. На рисунке 10 я сопоставил значения этих переменных со значениями других пространственных переменных. В этом случае «проблемные места» обозначаются заглавными буквами, что объясняется на рисунке 11. Я подведу итоги. Положение буквы «А», которая соответствует пространству 186 дома B1, очень сильно указывает на функцию мастерской, но также и на функцию входа.Пробел 955 в том же доме или буква «Б» не подходят ни для одной функции. Помещение 1052 дома B1 получает одинаковую поддержку как для входа, так и для приемной. Переходя к следующему зданию, дому B7, ни пространство 1213, ни пространство 2150 (заглавные буквы «D» и «E») не могут быть легко распределены по категориям на участках. Только «F», пространство 2151, кажется, немного вписывается в переходные пространства. Свидетельство того, что пространство 2511 дома G1, обозначенное буквой «G», однозначно: оно должно быть прежде всего переходным пространством, а не кухней.

    Следует учесть еще одну вещь. Экскаватор «Телль Мелебия» предложил наиболее укомплектованные дома разделить на 5 категорий строений. Категория А состоит из небольших домов квадратного плана и продолговатого основного пространства. К этой категории относятся дома B6, C2, G2 и, вероятно, C6. Категория B состоит из домов с центральным пространством, различающихся по размеру. Домики B2 и B3 относятся к категории B1. Дома B4, B5, C1, G1 и, вероятно, C5 среднего размера: категория B2.Наконец, категория B3 включает большие дома B1 и B7 с несколькими центральными помещениями. Сокращения для всех зданий, завершенных и незавершенных, поясняются на рисунке 13. Давайте посмотрим, можно ли отнести незавершенные здания к этим категориям, используя диаграммы пространственных переменных с надрезом. Также, возможно, мы сможем проверить предварительное членство дома C6 в категории A и дома C5 в категории B2.

    На рисунке 12 прямоугольная диаграмма RRA для строительства подтверждает тот факт, что категория B отличается от категории A.То же самое верно и для коробчатого графика среднего DpS. Однако средние определенные значения DpS не показывают такого разделения. Дом категории А действительно отличается от дома категории В. Категория B2 отделена от B1 и B3. Дом к северу от дома B6, кажется, принадлежит к категории B, а северо-западный квартал области B ни к чему не подходит. Последнее здание может входить в категорию B2 или B3 в соответствии со средней коробчатой ​​диаграммой DW. Наконец, график средней площади показывает, что дома категории A обычно имеют меньшее пространство, чем дома B.Дом C6 склоняется к категории B, а дом C5 — к категории A, что противоречит предложению доктора Лебо. Построение двух пространственных переменных не дало много дополнительной информации из-за слишком малого количества доступных значений для домов C5 и C6.

    В заключение я думаю, что этот подход пространственного анализа не оказался полностью успешным в тематическом исследовании Телль Мелебия. Выборка, скорее всего, была слишком мала, чтобы позволить выявить более последовательные корреляции и закономерности.Тем не менее, пространственный анализ является чрезвычайно интересным дополнением к инструментам, которыми мы располагаем при изучении археологических памятников, обнаруженных при раскопках.

    Конечные примечания

    (1) М. Лебо, Телль Мелебия. Cinq campagnes de recherches sur le Moyen-Khabour (1984-1988) (Akkadica Supplementa, 9), Лёвен, 1993; планы на рисунке 6 были адаптированы из этой публикации.

    (2) Эта статья является частью моего продолжающегося исследования, связанного с пространственным анализом зданий:

    — «Исследование моделей доступности и циркуляции в храме Греха Хафаги в третьем тысячелетии до нашей эры.C., «в Mesopotamia , 27 (1992), pp. 89-118
    — Пространственный анализ месопотамских построек от позднего бронзового века до парфянского периода , доктор философии. диссертация, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес, 1994
    — «Расстояния и статистика, или другой метод анализа зданий. Тест с месопотамскими домами позднего бронзового и железного веков», Akkadica , 89-90 (сентябрь-декабрь 1994), стр. 1-8
    — «Тестовое исследование схем обращения и доступа в ассирийской архитектуре», в H.Waetzoldt и H. Hauptmann (ред.), Assyrien im Wandel der Zeiten. XXXIXe Rencontre Assyriologique Internationale, Гейдельберг 6. – 10. Juli 1992 (Heidelberger Studien zum Alten Orient, 6), Heidelberg, 1997, стр. 239-246
    — «Дискриминантный анализ с помощью избранных пространственных переменных, полученных из месопотамских зданий от позднего бронзового века до парфянского периода», выйдет в году, Месопотамия .

    (3) См. Особенно Б. Хиллер и Дж. Хэнсон, Социальная логика пространства , Кембридж и Сидней, 1984.

    (4) См. Среди прочего: «Пространство и поведение сообщества: обсуждение формы и функции пространственного порядка в поселениях», в Б. Ллойд и Дж. Гей (ред.), Универсалии человеческой мысли. Некоторые африканские свидетельства , Кембридж и Сидней, 1981, стр. 71–110; «Определение пространственного беспорядка», в A. McNicoll, Taskun Kale. Keban Rescue Excavations Eastern Anatolia (Британский институт археологии в Анкаре, Монографии, 6 = Британские археологические отчеты. Международная серия, 168), Оксфорд, 1983, стр.193-241.

    Фигуры

    1 — Пример плана этажа и схемы
    2 — Пример плана этажа и схемы после изменения
    3 — Пример таблицы RA
    4 — Пример таблицы RA после изменения
    5 — Формулы пространственного анализа и сокращения
    6 — Поэтажные планы наиболее полных домов

    Дом B1
    Дом B2
    Дом B4
    Дом B6
    Дом B7
    Дом C2
    Дом G1
    Дом G2
    7 — RRA схемы наиболее полных домов
    Дом B1
    Дом B2
    Дом B4
    Дом B6
    Дом B7
    Дом C2
    Дом G1
    Дом G2
    8 — Сокращения функций
    9 — Распределение пространственных переменных пространств по функциям
    Пример прямоугольной диаграммы
    Реальная относительная асимметрия
    Дверных проемов на пространство
    Определенных дверных проемов на пространство
    Самая длинная сторона
    Самая короткая сторона
    Средняя ширина двери
    Площадь
    10 — Графики выбранных значений пространственных переменных для пространств по функциям
    Площадь и реальная относительная асимметрия
    Площадь и дверные проемы на пространство
    Площадь и определенные дверные проемы на пространство
    Площадь и самая длинная сторона
    Площадь и самая короткая сторона
    Площадь и средняя ширина двери
    Определенные дверные проемы на пространство и реальная относительная асимметрия
    Определенные дверные проемы на пространство и самая длинная сторона
    Определенные дверные проемы на пространство и самая короткая сторона
    Определенные дверные проемы на пространство и средняя ширина двери
    11 — Аббревиатуры «Проблемные места»
    12 — Распределение пространственных переменных для зданий по категориям зданий
    Реальная относительная асимметрия здания
    Средние дверные проемы на пространство
    Средние определенные дверные проемы на пространство
    Средняя самая длинная сторона
    Средняя самая короткая сторона
    Средняя средняя ширина двери
    Средняя площадь
    13 — Сокращения зданий Рисунок 1 — Пример плана этажа и схемы

    Рисунок 2 — Пример плана и схемы этажа после изменения

    Рисунок 3 — Пример таблицы RA

    Рисунок 4 — Пример таблицы RA после изменения

    Рисунок 5 — Формулы пространственного анализа и сокращения

    Рисунок 6 — Поэтажные планы наиболее завершенных домов

    Дом Б1 (уровень 2)

    Дом В2 (уровень 2)

    Дом Б4 (уровень 2)

    Дом B6 (уровень 2)

    Дом B7 (уровень 2)

    Дом С2 (уровень 3)

    Дом G1 (уровень 2)

    Дом G2 (уровень 2)

    Рисунок 7 — RRA схемы наиболее завершенных домов

    Дом Б1 (уровень 2)

    Дом В2 (уровень 2)


    Дом Б4 (уровень 2)

    Дом B6 (уровень 2)

    Дом B7 (уровень 2)

    Дом С2 (уровень 3)

    Дом G1 (уровень 2)

    Дом G2 (уровень 2)

    Рисунок 8 — Сокращения функций

    Рисунок 9 — Распределение пространственных переменных для пространств по функции

    Пример прямоугольной диаграммы

    Реальная относительная асимметрия

    Дверных проемов на место

    Определенных дверных проемов на место

    Самая длинная сторона

    Самая короткая сторона

    Средняя ширина двери

    Площадь

    Рисунок 10 — Графики значений выбранных пространственных переменных для пространств по функции

    Площадь и действительная относительная асимметрия

    Площадь и дверные проемы на место

    Площадь и определенные дверные проемы на место

    Площадь и самая длинная сторона

    Площадь и кратчайшая сторона

    Площадь и средняя ширина двери

    Определенные дверные проемы на пространство и реальная относительная асимметрия

    Определенные дверные проемы на место и самая длинная сторона

    Определенные дверные проемы на место и кратчайшая сторона

    Определенные дверные проемы на место и средняя ширина двери

    Рисунок 11 — Сокращения «Проблемных пространств»

    Рисунок 12 — Распределение пространственных переменных для зданий по категориям зданий

    Построение реальной относительной асимметрии

    Среднее количество дверных проемов на помещение

    Среднее количество дверных проемов на пространство

    Средняя длинная сторона

    Средняя короткая сторона

    Средняя средняя ширина двери

    Средняя площадь

    Рисунок 13 — Аббревиатуры корпусов

    Вы можете посетить домашнюю страницу автора Вы также можете связаться с ним по электронная почта

    Эта веб-страница была создана автором на компьютере Macintosh.

    способов взаимодействия Escherichia coli Dps с ДНК по данным атомно-силовой микроскопии

    Abstract

    Многофункциональный белок Dps играет важную роль в ассимиляции железа и решающую роль в упаковке бактериального генома. Его мономеры образуют додекамерные сферические частицы, накапливающие ~ 400 молекул окисленных ионов железа внутри белковой полости и применяющие гибкие N-концевые концы каждой субъединицы для взаимодействия с ДНК.Осаждение железа — хорошо изученный процесс, с помощью которого клетки удаляют токсичные ионы Fe 2+ из генетического материала и сохраняют их в легкодоступной форме. Однако способ взаимодействия с линейной ДНК оставался загадкой, а бинарные комплексы с Dps до сих пор не охарактеризованы. Широко распространено мнение, что Dps связывает ДНК без какой-либо последовательности или структурных предпочтений, но несколько линий доказательств продемонстрировали его способность дифференцировать экспрессию генов, которая предполагает определенную специфичность.Здесь мы показываем, что Dps имеет различное сродство к двум фрагментам ДНК, взятым из регуляторной области гена dps . С помощью атомно-силовой микроскопии мы обнаружили, что Dps преимущественно занимает термодинамически нестабильные концы линейных двухцепочечных фрагментов ДНК и имеет высокое сродство к центральной части разветвленной молекулы ДНК, самоорганизующейся из трех одноцепочечных олигонуклеотидов. Было высказано предположение, что Dps предпочитает связывание с теми областями в ДНК, которые обеспечивают больше контактных площадок для триады его ДНК-связывающего пучка, связанного с одной вершиной белковой глобулы.Насколько нам известно, это первое исследование, в котором был обнаружен нуклеоидный белок, имеющий сродство к разветвленной ДНК, типичное для участков генома с прямыми и инвертированными повторами. Поскольку такие структурные элементы являются повсеместной особенностью бактериальных и эукариотических геномов, они требуют особого внимания, но белковая система, эволюционно адаптированная для этой функции, еще не известна, и мы предлагаем Dps в качестве предполагаемого компонента этой системы.

    Образец цитирования: Мелехов В.В., Швырева Ю.С., Тимченко А.А., Тутукина М.Н., Преображенская Е.В., Буркова Д.В. и др.(2015) Режимы взаимодействия Escherichia coli Dps с ДНК по данным атомно-силовой микроскопии. PLoS ONE 10 (5): e0126504. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504

    Академический редактор: Дипанкар Чаттерджи, Индийский институт науки, ИНДИЯ

    Поступила: 17 ноября 2014 г .; Одобрена: 2 апреля 2015 г .; Опубликован: 15 мая 2015 г.

    Авторские права: © 2015 Melekhov et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

    Доступность данных: Все данные содержатся в бумага.

    Источник финансирования: Работа поддержана Российским научным фондом (ОНО, грант 14-04-00985, http://rscf.ru/node/8), Министерством образования и науки Российской Федерации ( SSA, проект № 2504, http: // xn — 80abucjiibhv9a.xn — p1ai) и Российского фонда фундаментальных исследований (ONO, 13-04-00997, http://www.rfbr.ru/rffi/eng). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Все живые организмы используют определенные структурные белки, чтобы поддерживать свои геномы в функциональном состоянии и защищать их от повреждения различными физическими, химическими факторами и факторами окружающей среды.У эукариот основная ответственность за реализацию функциональности в безопасных условиях лежит на пяти положительно заряженных гистоновых белках, которые конденсируют или расслабляют определенные геномные локусы, взаимодействуя с ДНК без специфичности последовательности. У прокариот эту функцию выполняют 10–12 очень распространенных белков [1–3], которые взаимодействуют с ДНК, распознавая структурные особенности двойной спирали или даже связываясь со специфическими мотивами последовательностей в бактериальной хромосоме.

    В общей сложности около 170 000 молекул различных белков заботятся о структуре E . coli нуклеоида при экспоненциальном росте, а переход в стационарный режим сопровождается увеличением их количества до ~ 290 000 [1]. В быстрорастущих клетках наиболее распространенным нуклеоидным белком является Fis ( F актер и версия s тимуляция), количество которых достигает 60 000 молекул на клетку. В голодных клетках внутриклеточный уровень Fis снижается, в то время как доминирующим белком становится Dps ( D NA-связывающий p ​​ rotein s tarved клеток, 180 000 молекул на клетку) [1].Fis и по крайней мере четыре других структурирующих белка (IHF, Lrp, H-NS и его паралог StpA) распознают сайты, для которых может быть выведен консенсусный мотив [1, 4-7]. Два других нуклеоидных белка (CbpA и CbpB), а также H-NS и StpA связывают изогнутую ДНК [8–10]; тогда как HU ( H съедает u nstable protein) может образовывать комплексы с широким спектром различных геномных локусов, включая изогнутую, неупорядоченную, разорванную или крестообразную ДНК [11–13]. Информация о взаимодействии Dps с ДНК менее достоверна.Считается, что он образует только неспецифические комплексы с отрицательно заряженным сахарно-фосфатным остовом [1, 14–16].

    Большинство архитектурных белков бактериального нуклеоида действуют как гомо- или гетеродимеры (Fis, HU, CbpA, IHF, H-NS и StpA). DnaA и CbpB (Rob) действуют как мономеры, в то время как Lrp и Dps могут образовывать большие олигомерные частицы. В этой паре Lrp ( L эуцин-зависимый r egulatory p ​​ rotein) существует как смесь димеров, октамеров и гексадекамеров, равновесие которых зависит от присутствия лейцина, благоприятствующего конфигурации октамера.Сегмент ДНК, содержащий сайт связывания Lrp, оборачивается вокруг этого октамера, образуя структуру, подобную нуклеосоме [17]. Доминирующей олигомерной формой Dps является додекамер, который собирается из димеров [18] или тримеров [19]. Додекамеры прочно связываются с ДНК, но способность более мелких олигомеров образовывать аналогичные комплексы еще не была хорошо документирована.

    Два белка, которые взаимодействуют со специфическими последовательностями в ДНК (Fis и Lrp), имеют классические ДНК-связывающие домены спираль-поворот-спираль [20, 21]; в то время как большинство нуклеоидных белков полагаются на «косвенное считывание», т.е.е. используют разные структурные модули для распознавания их сайтов связывания в зависимости от конформационных особенностей, опосредованных последовательностью [22–24]. В Dps E . coli эта функция в первую очередь приписывается гибким N-концевым хвостам [16], содержащим три остатка лизина в положениях 5, 8 и 10 и остаток аргинина в положении 18. Делеция первых 8 или 18 аминокислот резко снизилась. способность Dps связывать ДНК и агрегировать с другими молекулами Dps [15], но рентгеноструктурный анализ не выявил типичных ДНК-связывающих модулей на N-концевых концах или любых других сегментах на поверхности белка [16].Таким образом, поражает близость E . coli Dps к ДНК в настоящее время понимается как сильное электростатическое взаимодействие между положительно заряженными боковыми цепями гибких белковых модулей и отрицательно заряженным остовом ДНК.

    Отсутствие N-концов (как у MsDps1 из Mycobacterium smegmatis [18, 19]) или их пониженная гибкость (как у MsDps1 из M . smegmatis [18], Dps Agrobacterium tumefaciens [25] ] и молекулы DpsA / DpsB Lactococcus lactis [26]) изменили способ взаимодействия или снизили способность связывания / конденсации ДНК [27].Таким образом, в Dps A . tumefaciens N-концов иммобилизованы на поверхности додекамеров сеткой водородных связей и солевых мостиков, вызывая подавление их способности связывать ДНК [25]. В обоих L . lactis Dps белки на N-концах образуют короткие α-спирали [26], выступающие на поверхности белка, и связывают соседние субъединицы посредством солевых мостиков и водородных связей. Эти α-спирали стабилизируют додекамерную структуру белка, а также участвуют во взаимодействии с ДНК, поскольку удаление первых 20 аминокислот из DpsA нарушает способность связывания ДНК.Но замена трех Lys в положениях 9, 15 и 16 на Glu не повлияла на взаимодействие с ДНК [26], вероятно потому, что эти остатки в структуре α-спиралей «либо обращены, либо расположены параллельно» поверхности додекамера [ 26]. Dps-гомолог Helicobacter pylori (HP-NAP) не содержит положительно заряженного N-конца, но вместо этого имеет положительно заряженную поверхность белка, которая напрямую взаимодействует с молекулами ДНК [28]. Таким образом, способ связывания Dps-ДНК может отличаться для молекул Dps от разных бактерий, но электростатические взаимодействия, скорее всего, играют решающую роль в этих процессах.

    Существует четыре теоретических модели, описывающих E . coli Взаимодействие Dps-ДНК на субмолекулярном уровне. Они основаны на данных, полученных с помощью электронной [14, 26, 29–32] или атомно-силовой [15, 18, 28] микроскопии с ограниченным разрешением. Первый был предложен Almiron et al. [14] для объяснения электронных микрофотографий E . coli Dps: комплексы ДНК, наблюдаемые как высокоупорядоченные двумерные сотовые массивы [14, 29].Модель предполагает образование двух связанных гексамерных колец мономеров Dps вокруг двойной спирали ДНК. Однако ДНК-индуцированная конформационная перестройка сферических додекамерных частиц или сборка гексамерных колец из димеров или тримеров еще не зарегистрированы. Вторая модель основана на наблюдении крупных сокристаллов Dps-ДНК [30, 31]. Это предполагает способность Dps образовывать стопки чередующихся слоев, внутри которых ДНК изолирована в полостях между соседними додекамерами.Такие сокристаллы были обнаружены в голодных клетках, содержащих огромное количество Dps [30], и имеют решающее значение для защиты ДНК от множества повреждающих агентов. Однако в экспоненциально растущих клетках Dps был обнаружен как белок, равномерно распределенный по всему нуклеоиду [33].

    Третья модель учитывала тот факт, что при физиологических значениях pH как внешняя, так и внутренняя поверхности глобулы Dps заряжены отрицательно (IP = 6,01). Итак, белок должен отталкивать, а не притягивать ДНК. Поскольку присутствие ЭДТА ингибирует связывание ДНК, было высказано предположение, что это взаимодействие опосредуется мостиками, образованными ионами металлов между отрицательно заряженной поверхностью белка и скелетом ДНК [30–32, 34, 35].Хотя эта модель не учитывает функциональность положительно заряженных N-концов, ее, вероятно, можно рассматривать как наиболее универсальную, поскольку несколько линий доказательств указывают на зависимость образования комплекса Dps-ДНК от Mg 2+ [30–32, 34] или Fe 2+ [35]. Наконец, модель, предложенная К. Зетом [36], подчеркивает способность Dps к неспецифическому связыванию ДНК и предполагает, что ДНК навивается вокруг округлой додекамерной частицы гистоноподобным образом.

    Нуклеоидные белки с последовательностью или структурной специфичностью участвуют в дифференциальной регуляции генов [37].Такая информация для Dps в основном отсутствует. Тем не менее, было задокументировано, что dps -нулевой мутант E . coli имел значительные изменения в профиле белка [14], и микроматричный анализ был проведен для dps -нулевого мутанта S . enteritidis [38] выявил сотни генов с dps -зависимой транскрипцией. Мы также обнаружили, что делеция dps влияет на транскрипцию определенных генов, оставляя экспрессию других геномных локусов E . coli без изменений [39]. Все эти факты предполагают некоторую специфичность в связывании Dps-ДНК, и здесь мы попытались пролить свет на эту проблему с помощью трех различных подходов, используя фрагменты ДНК разной длины, последовательности и структурной организации. Наша цель была подкреплена тем фактом, что Dps — это уникальный белок в семействе структурирующих факторов, обеспечивающий не только физическую, но и химическую защиту от повреждающих агентов. Высококонсервативный ферроксидазный центр Dps обеспечивает секвестрацию токсичных ионов Fe 2+ , что позволяет избежать образования гидроксильных радикалов с помощью химии Фентона [40].Окисленные ионы железа затем накапливаются внутри белковой полости и могут высвобождаться при восстановлении. Эта полость может вместить более 400 оксидов железа и может содержать оксиды других металлов, которые изменяют ферромагнитные свойства минерализованного ядра. Таким образом, сейчас Dps рассматривается как очень перспективная биомолекула для наноэлектроники, дающая возможность создавать наноустройства с калиброванными ферромагнитными частицами [41]. Некоторая специфичность способа взаимодействия с ДНК может быть очень благоприятной при разработке новых материалов с предсказуемым расположением этих частиц.

    Материалы и методы

    Очистка ДПС

    Модель E . Ген coli dps амплифицировали с праймерами TAATTTCTAGAACATAACATCAAGAGG и AGCTCTAGATTTATTCGATGTTAG и клонировали в вектор экспрессии pGEMΔXba [42] с использованием сайта Xba I. Нуклеотидную последовательность рекомбинантного гена, которая не была модифицирована какой-либо меткой, проверяли прямым секвенированием. Экспрессия гена осуществлялась в E . coli BL21 (DE3) клеток, выращенных в среде LB в присутствии ампициллина (100 мкг / мл) при 37 ° C.Транскрипцию рекомбинантного гена индуцировали 0,02 мМ IPTG при OD600 0,4–0,6, а накопление белка позволяли в течение 12 часов. Его очищали с помощью ионообменной хроматографии (DEAE-Sephadex A-25, GE Healthcare, Швеция) и гель-фильтрации на Sephadex G-200 (Pharmacia, Швеция). Белок концентрировали на колонках Vivaspin 20 (Sartorius, Германия), диализовали против буфера для хранения, содержащего 50 мМ трис-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA, 5% глицерина, и хранили в морозильной камере.Конечная чистота нативного белка была выше 95%.

    Получение фрагментов ДНК

    линейных фрагментов ДНК получали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК E . coli K12 MG1655 и праймеры (Евроген, Россия), перечисленные в таблице 1. После ПЦР эти фрагменты ДНК очищали от субстратов и праймеров с помощью 5% -ного ПААГ-электрофореза, экстрагировали и растворяли в воде milliQ. Концентрацию фрагментов ДНК определяли на спектрофотометре ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc., СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).

    Разветвленные молекулы ДНК были образованы из двух или трех одноцепочечных олигонуклеотидов (Таблица 1), сконструированных таким образом, что каждая половина одного фрагмента была комплементарной половинкам одного или двух других фрагментов (Таблица 1). Олигонуклеотиды растворяли в 5 мМ растворе MgCl 2 , плавили отдельно при 97 ° C в течение 5 минут, смешивали и дополнительно инкубировали при 97 ° C в течение 5 минут. Затем смесь переносили на водяную баню с температурой 70 ° C на 10 минут и давали постепенно остыть до комнатной температуры (4–5 часов).

    Анализ сдвига электрофоретической подвижности

    Комплексы

    ДНК-Dps получали смешиванием фрагментов ДНК с Dps в различных молярных соотношениях в 10 мкл буфера, который содержал 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 0,1 мМ EDTA и 50 мМ NaCl. Образованию комплекса давали возможность в течение 30 минут при 37 ° C. Эффективность связывания оценивали с помощью анализа сдвига геля, как описано в [43]. Электрофоретическое фракционирование проводили в 5% ПААГ в буфере ТВЭ (89 мМ Трис-HCl, 89 мМ Борная кислота, 2 мМ ЭДТА, pH 8.0) при 200–250 В и 70–110 мА. Полосы ДНК окрашивали бромидом этидия или AgNO 3 .

    След ДНК азы I

    5’-концы праймеров dps _F1 и dps _R2 (таблица 1) были мечены 32 P с использованием полинуклеотидкиназы Т4 (Thermo Scientific, Литва) и протокола производителя. ПЦР амплифицировали три фрагмента ДНК с парами праймеров 32 P- dps _F1— dp s_R1, dps _F1 — 32 P- dp s_R2 и dps _F2 — 32 P- dps _R2.Амплифицированные фрагменты экстрагировали из геля, как описано в [44]. Перед образованием комплекса образцы ДНК (1 пмоль на реакцию) инкубировали в течение 10 минут при 37 ° C в 30 мкл транскрипционного буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 0,1 мМ EDTA, 0,1 мМ DTT, 10 мМ MgCl 2 , 50 мМ NaCl и 5 мг / мл БСА (Sigma, США). Затем добавляли белок Dps в 2–10-кратном молярном избытке и оставляли взаимодействие в течение 40 минут при 37 ° C. Затем образцы обрабатывали 1 мкг / мл ДНКазы I в течение 2 минут.Расщепление прекращали добавлением 35 мкл 8 М ацетата аммония. Продукты переваривания ДНКазой 1 осаждали этанолом, растворяли в формамидном буфере [44] и наносили на 6% денатурирующий полиакриламидный гель. Образцы фракционировали в буфере TBE и визуализировали с помощью радиоавтографии. Гели калибровали по лестнице G-секвенирования.

    Пробоподготовка для атомно-силовой микроскопии (АСМ)

    Сохраненные растворы очищенных Dps пропускали через колонку Sephadex G-15 (1×5 см, 3 ) для удаления любых агрегированных частиц.Собранные фракции разбавляли в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5) и 10 мМ NaCl, до конечной концентрации 1 нг / мкл (4,4 нМ додекамеров) и 2 мкл этого раствора наносили на слюду для сканирования. Линейные фрагменты ДНК или Y-образные структуры растворяли в 5 мМ MgCl 2 до концентрации 1 нг / мкл (4–19 нМ). Комплексы Dps с различными фрагментами ДНК формировали при комнатной температуре в буфере: 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ NaCl и 5 мМ MgCl 2 (10 мкл) в течение 30 минут и наносили на слюду.Для образования комплекса использовали трех-десяти молярный избыток линейных фрагментов ДНК или пятидесяти молярный избыток разветвленных молекул. Аналогичным образом готовили контрольные образцы, но без Dps. Все образцы выдерживали на слюде в течение 5 минут, дважды промывали водой в течение 30 секунд, сушили и структуру образовавшихся комплексов анализировали на АСМ Интегра-Вита (НТ-МДТ, Россия) с использованием кантилеверов NSG03 с радиусом кривизны кончика 10 нм и Резонансная частота 47–150 кГц. Измерения проводились в полуконтактном (постукивающем) режиме.Полученные изображения анализировали в программе Nova (NT-MDT, Россия).

    Получение разорванной ДНК

    Для наблюдения комплексов Dps с ДНК, содержащей одноцепочечные разрывы, 10 мкг плазмиды pET28b обрабатывали никазой Nt.BspD6I [45]. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ MgCl 2 , 150 мМ KCl, 1 мМ DTT и 10 единиц никазы или равный объем буфера для хранения Nt.BspD6I (10 мМ Tris- HCl, pH 7,5, 50 мМ KCl, 0,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 50% глицерин) для экспериментального или контрольного образца соответственно.Переваривание оставляли на 1 час при 55 ° C. Плазмидную ДНК немедленно собирали экстракцией фенол-хлороформ, осаждали этанолом и растворяли в воде. Кривые плавления были получены для обеих плазмид, что подтвердило образование трещин. Комплексы с Dps в молярном соотношении Dps: ДНК 5: 1 или 10: 1 получали, как описано выше.

    Результаты

    Dps имеет разное сродство к двум фрагментам области промотора

    dps

    Уже известно, что делеция dps изменила профиль белков в голодном E . coli клеток [14] и изменил профиль транскрипции в S . enteritidis [38] и E . coli [39]. Но этот очевидный регуляторный эффект может быть опосредован взаимодействием с регуляторными белками, занимающими их сайты связывания, которые высвобождаются в мутанте dps -null. Другими словами, данные, полученные in vivo , наводят на размышления, но их недостаточно, чтобы отказаться от традиционной точки зрения, согласно которой Dps взаимодействует с ДНК без какой-либо специфичности [1–3, 14–16].Мы также ранее обнаружили, что две A / T-богатые области, содержащие « островок промотора » yeaI и промоторы dps , имеют более высокое сродство к Dps, чем два линейных фрагмента ДНК, представляющих кодирующие последовательности и межгенное пространство, расположенное между конвергентными генами [ 46]. Эти эксперименты были выполнены in vitro в отсутствие какой-либо конкуренции с регуляторными белками, что увеличивало возможность селективного взаимодействия. Поскольку факторы транскрипции обычно влияют на экспрессию их собственных генов, регуляторная область dps была выбрана как наиболее многообещающий кандидат для демонстрации «специфического» связывания.Таким образом, фрагмент 420 п.н., охватывающий регуляторную область гена dps и взаимодействующий с белком Dps, был разделен на две половины. Один (длиной 259 п.н.) был получен методом ПЦР с праймерами dps _F2 и dps _R2 (таблица 1) и включал основной промотор этого гена — P dps [47, 48]. Другой (длиной 214 п.н.) содержал дистальный промотор-подобный сайт P3, который демонстрировал низкую транскрипционную активность, но был важен для максимальной экспрессии dps [49].

    Поскольку ДНК-связывающая активность Dps обычно сопровождается самоагрегацией, а агрегированные комплексы не попадают в гель [1, 14, 19, 35, 39, 49], эффективность связывания оценивали на основе оставшейся свободной ДНК. несвязанный. Используя смешанные анализы, содержащие обе половины регуляторной области в одном образце, мы наблюдали, что фрагмент с функциональным промотором имеет более высокое сродство к Dps, чем дистальная часть регуляторной области (рис. 1A). Таким образом, стало ясно, что образуя комплексы со всеми протестированными фрагментами ДНК [39], Dps может с определенной селективностью связываться с промоторной областью собственного гена.Затем мы попытались локализовать сайт связывания Dps в этой области с помощью метода отпечатков ДНКазы I (рис. 1B). Но обнаружив множественные гиперреактивные сайты и наблюдая четко защищенные R1- и F2-концы (схема на рис. 1C) в обоих небольших фрагментах при большом молярном избытке Dps (10-кратный), при 5-кратном избытке мы обнаружили только несколько защищенных полос (~ На 175 и ~ 113 п.н. ниже праймера dps _F1 и в области 120–151 п.н. выше праймера dps _R2). Последний воспроизводимо наблюдался в комплексах как с короткими (F2-R2), так и с длинными (F1-R2) фрагментами, предполагая некоторую специфичность в этом связывании.Вот почему на следующем этапе мы использовали атомно-силовую микроскопию (АСМ) для характеристики общей топологии комплексов Dps-ДНК.

    Рис. 1. [A]: Пример анализа сдвига электрофоретической подвижности, выполняемого, как описано в разделе «Материалы и методы».

    Один пмоль фрагмента ДНК длиной 214 п.н., амплифицированного с праймерами dps _F1 и dps _R1 (обозначенный как F1-R1), загружали только на дорожку 1 в качестве независимого маркера. Другие образцы содержали два фрагмента (по 1 пмоль каждый) и Dps, как указано выше на фотографии.Гель калибровали по маркерной лестнице (M). [B] Анализы футпринтинга ДНКазы I, выполненные для комплексов Dps с фрагментами ДНК F1-R1, F2-R2 и F1-R2. 32 Р-меченные праймеры обозначены звездочками. Гели калибровали по продуктам лестницы G-секвенирования. Позиционные метки показывают расстояние до 32 P-меченных праймеров F1 или R2. Защищенные сайты отмечены пунктиром. Гиперреактивные сайты не помечаются. [C] : Схема, иллюстрирующая относительное расположение и структурную организацию проанализированных фрагментов.Прямые и инвертированные повторы в их последовательностях усилены и дополнительно обозначены стрелками. Соответствующие полосы в [B] обозначены открытыми и серыми стрелками для прямых и инвертированных повторов соответственно. Изогнутая стрелка указывает сайт начала транскрипции в промоторе P dps .

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g001

    Взаимодействуя с линейными фрагментами ДНК. Dps обычно связывает концы двухцепочечных молекул

    Рис. 2A демонстрирует изображения очищенного Dps с помощью АСМ.Большинство наблюдаемых частиц имели квазисферическую форму с высотой около 7 нм, что хорошо согласуется с ожидаемым размером [16]. Расчетный вертикальный размер разнесенных молекул ДНК составлял 2 нм ( Fig 2B – 2D ) , что также точно соответствует ожидаемому значению. Однако планарные размеры на АСМ-изображениях зависят от конечного размера острия кантилевера (в нашем случае R = 10 нм), а точность их измерения зависит от размера объекта. Таким образом, видимые диаметры белковых частиц в плоской проекции составляли 27–32 нм, кажущаяся ширина двойной спирали ДНК — ~ 21 нм, а длины ДНК-фрагментов 214, 259 и 420 п.н. составляли 76, 93 и 146 нм, т.е. .е. лишь немного больше ожидаемых значений (73, 88 и 143 нм соответственно). Таким образом, длину длинных молекул ДНК можно оценить достаточно точно.

    Рис. 2. АСМ изображения.

    [A] : белок Dps; [BD] : ДНК-фрагменты, содержащие соответственно полную регуляторную область гена dps (420 п.н., праймеры dps_ F1 и dps_ R2), его проксимальный (259 п.н., праймеры dps_ F2 и dps_ ). R2) и дистальной (214 п.н., праймеры dps_ F1 и dps_ R1) части.Панели b и c : комплексы, образованные Dps с 214 п.н. (b) и 259 п.н. (c) ДНК-фрагментами. Белые шкалы представляют 100 нм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g002

    Все образцы белка оказались довольно однородными, обычно содержащие менее 20% частиц меньше, чем додекамеры. Удивительно, но они не были загрязнены фрагментами ДНК, плотное связывание которых составляло , а априорное ожидалось [14, 15], или агрегатами (рис. 2А).Однако образование комплекса с ДНК вызвало сильную агрегацию. Удаление агрегатов путем промывки образцов слюды позволило зарегистрировать индивидуальные комплексы Dps как с короткими фрагментами ДНК, так и для анализа сдвига электрофоретической подвижности, а также отпечатков пальцев (рис. 1). В обоих случаях мы наблюдали взаимодействие белковых частиц с концами молекул ДНК (рис. 2B и 2C). Мы не видели каких-либо упорядоченных двумерных массивов, ранее зарегистрированных электронной микроскопией [14, 29–32, 34, 36].Но это было ожидаемо, поскольку такие комплексы никогда не наблюдались с помощью АСМ [15, 18, 28], и мы намеренно удалили агрегаты путем интенсивной промывки. Мы также не нашли гексамерных колец, охватывающих ДНК [14], или убедительных доказательств того, что нуклеосомоподобная ДНК обвивается вокруг сферических частиц Dps [36], чего можно было ожидать в рамках существующих моделей. Но мы также не обнаружили большого количества молекул Dps, взаимодействующих с внутренними частями линейных фрагментов ДНК. Даже если такие комплексы могут быть специфически вымыты агрегированным белком, стало ясно, что Dps может связывать концы двухцепочечной ДНК.Поскольку фрагменты F1-R1 и F2-R2 перекрываются на 53 п.н. в их A / T-богатых концах R1 и F1, в то время как две другие области с высоким содержанием A / T соответствуют оставшимся двум областям контакта с Dps (рис. 1B и 1C), мы предположили, что более высокое сродство этого белка к F2- Фрагмент R2 (рис. 1А) тривиально объясняется его более низкой термодинамической стабильностью (65 и 58% для фрагментов F2-R2 и F1-R1 соответственно).

    Y-образные разветвленные конструкции — идеальные мишени для Dps

    Две конструкции использовали для оценки сродства Dps к A / T-богатой ДНК.Один из них был построен из 2 синтетических олигонуклеотидов Y1 (57 n) и Y3 (64 n) (таблица 1) как искусственная модель концов ДНК. У него был стабильный G / C-ствол и две гибкие одноцепочечные ветви, одна из которых состояла из аденинов (рис. 3A). Если Dps имеет повышенное сродство к одноцепочечной ДНК, мы ожидали найти его в комплексе с этими одноцепочечными ветвями, в то время как G / C-стебель мог выступать из образованных комплексов. Другая конструкция была построена из олигонуклеотидов Y1, Y2 и Y3 (таблица 1) и содержала три ветви.Две длинные ветви в этой молекуле имели только пары оснований G / C, в то время как короткая содержала только пары A / T и могла быть идеальной мишенью для концевого специфического взаимодействия (Рис. 3B). В этом случае мы ожидали найти Dps в конце короткой ветви.

    Рис. 3. Комплексы, образованные ДПС с четырьмя искусственными разветвленными конструкциями, схематично тонут на каждом участке.

    Последовательность цветных кружков соответствует последовательности используемых олигонуклеотидов (таблица 1). Панели демонстрируют изображения АСМ, полученные для свободных образцов ДНК и их комплексов с Dps (левое и правое сканирование соответственно).Сборку конструкций ДНК и формирование комплекса выполняли, как описано в разделе «Материалы и методы». Вставка на правой панели Рис. D иллюстрирует трехмерное изображение комплексов, образованных триплексом Y5_Y6_Y8. Хорошо видны концы всех трех ветвей. Белые полосы представляют масштабы 100 нм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g003

    На левой панели на рис. 3A показан пример свободных молекул ДНК, собранных из праймеров Y1 и Y3. Все они выглядят как зерна, но не как молекулы Y-образной формы.Это может быть связано со способностью гуанинов к квазикомплементарному взаимодействию с аденинами и гуанинами. В результате кажущийся продольный размер большинства наблюдаемых частиц составляет около 25 нм, что меньше, чем ожидалось для полностью вытянутого дуплекса (32 * 0,34 + 32 * 0,59 = 29,8 нм). Также возможно, что эти бинарные комплексы по своей сути гетерогенны, поскольку 3′-концевой C Y1 может связывать не только 5′-концевой G Y3, но также и любой другой гуанин в его поли G-последовательности, тем самым создавая смесь разные дуплексы.Однако все они должны содержать хотя бы небольшую часть одноцепочечной ДНК. Помимо зерен длиной 25 нм, мы также наблюдали более мелкие частицы с размером, варьирующимся в диапазоне 13–20 нм, которые могут представлять собой одиночные олигонуклеотиды, образующие квадруплексы или другие вторичные структуры.

    Добавление Dps изменило структуру этих частиц. Однако вместо обнаружения ожидаемых двухцепочечных спиралей, вытянутых из бинарных комплексов, мы наблюдали 2–4 неупорядоченных одноцепочечных хвоста ДНК (Рис. 3A).Эти хвосты имели видимую длину ~ 14–60 нм. Если принять во внимание ожидаемые ошибки в плоских проекциях, их можно рассматривать как два олигонуклеотида с расчетной длиной 34 и 38 нм, прикрепленные своими концами или внутренними частями к N-концам (или поверхности) Dps, или как одноцепочечные ветви. двух Y-образных молекул, одновременно взаимодействующих с одним белком. В обоих случаях максимальная длина наблюдаемых одноцепочечных хвостов больше, чем одноцепочечных ветвей в правильно собранном дуплексе (15–20 нм), что указывает на то, что начальное связывание Dps с зерноподобными частицами было достаточно сильным, чтобы перестроить их структура и удерживать неупорядоченные молекулы.

    разветвленных молекул ДНК на фиг. 3B были собраны из праймеров Y1, Y2 и Y3 (таблица 1). Они сформировали конструкции, напоминающие Y-образную форму (левая панель), но состояли из асимметричного модуля V-образной формы и меньшего домена, связанного с основной частью. Размер этого ассоциата точно соответствовал мелким зернам на рис. 3A, в то время как длина модуля V-формы варьировалась в диапазоне 24–30 нм (ожидаемый размер в самом длинном измерении составлял: 64 * 0,34 = 21,8 нм) и среднее соотношение между двумя сторонами было равно 0.88 (ожидаемое значение: 57/64 п.н. = 0,89). Таким образом, существует вероятность того, что самосборка наблюдаемых частиц происходила через образование комплементарного триплекса, связанного с дуплексом неканоническим спариванием оснований. Электрофоретическое фракционирование этих комплексов действительно выявило две полосы, соответствующие триплексу и дуплексу (рис. 4, дорожка 1). Более короткая сторона V-образного модуля (Рис. 3B), скорее всего, соответствовала A / T ветви, в то время как одна G / C ветвь была конформационно скрыта и может контактировать с небольшим ассоциатом.Ориентация триплекса по отношению к этому ассоциату была случайной, предполагая, что они собираются независимо от олигонуклеотидов. Смесь собранных молекул также содержала 10–20% более крупных частиц Y-формы (длина: 53–62 нм, высота: в среднем 2,6 нм), вероятно, образованных из триплексов и дуплексов, уложенных стопкой из-за квазикомплементарного взаимодействия квадруплексного типа вдоль G-прядь.

    Рис. 4. Анализы сдвига электрофоретической подвижности, выполненные для комплексов Dps с Y-образными конструкциями Y1_Y2_Y3 (заглушка на фиг. 1B) и Y5_Y6_Y7 (аналогично Y5_Y6_Y8, утопленная на фиг.1D, но без однонитевой петли).

    Состав образцов и молярное соотношение Dps: ДНК указаны над фотографиями. Молекулы разветвленной ДНК собирали из указанных олигонуклеотидов, смешанных в равных концентрациях (2–5 пмоль каждый), и получали, как описано в разделе «Материалы и методы». Без предварительного фракционирования их использовали для образования комплекса с Dps. Количество Dps было выбрано исходя из предположения, что все олигонуклеотиды образуют триплекс, как в случае Y5_Y6_Y7. Следовательно, указанные молярные отношения для Y1_Y2_Y3 завышены.Гели калибровали по маркерным фрагментам ДНК (M) и окрашивали AgNO 3 , чтобы визуализировать как молекулы ДНК, так и Dps.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g004

    Обе Y-образные структуры взаимодействовали с Dps, но белок в этом случае обнаружен только в центральной части разветвленных искусственных конструкций (правая панель на рис. 3Б). В комплексных комплексах он не препятствует связыванию с концом A / T- или G / C ветви верхней молекулы.Но небольшие конструкции с кажущимся размером 24-30 нм также не обнаруживают концевого специфического связывания (вставки на правой панели фиг. 3B). Поскольку размер этих конструкций был такой же, как кажущийся диаметр Dps в плоской проекции, они были почти полностью покрыты белком, хотя концы всех трех ветвей были видимыми и идентифицируемыми.

    Чтобы сравнить сродство Dps к триплексу Y1_Y2_Y3 и соответствующим бинарным структурам, мы приготовили смесь их самоорганизованных молекул и, без фракционирования, подвергли ее взаимодействию с Dps (рис. 4 дорожки 1-3).Трехкратный молярный избыток белка был достаточен для связывания всех образованных триплексов, в то время как большинство дуплексов оставалось свободным. Основываясь на этих данных, мы предположили, что Dps может связывать одноцепочечную ДНК и даже плавить двойную спираль (рис. 3A), но разветвленные конструкции, которые обеспечивают дополнительную двухцепочечную платформу для взаимодействия с положительно заряженными N-концами, могут быть более предпочтительными мишенями.

    Затем мы обнаружили, что способ взаимодействия, зарегистрированный для конструкции Y1_2_3 (рис. 3B), не был следствием ее специфической первичной структуры, поскольку молекулы Y-формы строятся из олигонуклеотидов с естественными последовательностями Y5, Y6 и Y7 или Y8, образующими тот же тип. комплексов.Первая половина Y5 (32 нуклеотида) и последняя половина Y6 были взяты из перекрывающейся части фрагментов F1-R1 и F2-R2 (рис. 1C). Самосборка этих конструкций из 96 п.н. (пример для Y5_Y6_Y7 на фиг. 4, дорожка 4) была намного более эффективной, чем в случае триплекса Y1_2_3 (фиг. 4, дорожка 1). Поэтому в смеси осталось очень небольшое количество дуплексов. Тем не менее, при 2-кратном молярном избытке белка, когда количество триплексов значительно снижается, несвязанные дуплексы все еще обнаруживаются (дорожка 6).Таким образом, вероятно, что среди разветвленных молекул с одно- и двухцепочечными разветвлениями Dps в основном выбирает последние.

    Две модификации были использованы для повышения качества АСМ-изображений, полученных для комплексов Dps с разветвленной ДНК. Во-первых, мы добавили 26 нуклеотидов к 5’-концу Y5 и к 3’-концу Y6 (9 нм), чтобы увеличить длину триплекса (Таблица 1 и Рис. 3C). Сайт, защищенный Dps против ДНКазы I, который расположен на 175 п.н. ниже праймера dps _F1 (фиг. 1B и 1C), был таким образом включен в конструкцию.В результате мы наблюдали комплексы с четко видимыми одной или двумя ветвями ДНК (рис. 3С, два правых столбца). В первом случае Dps может быть прикреплен к точке ветвления или к концу одного из коротких плеч, тогда как во втором случае взаимодействие с точкой ветвления кажется более вероятным, но третье плечо было плохо видно. Затем мы заменили динуклеотид TT во внутренней части Y_7 на AA (олигонуклеотид Y8). В результате новый триплекс Y5_Y6_Y8 имел короткую однонитевую петлю в одной ветви. Эта модификация немного сместила связанный белок от центра (рис. 3D), показывая концы всех трех ветвей (см. Трехмерное изображение на рис. 3D).Следовательно, Dps связывает 3-стороннее соединение и, вероятно, обладает определенной специфичностью по отношению к одноцепочечным или гибким участкам ДНК. Если это так, связывание Dps с одноцепочечными разрывами в природной ДНК может вызвать плавление, подобное тому, которое наблюдается на фиг. 3A. Чтобы проверить эту возможность, мы проанализировали комплексы, образованные Dps, с нативной и разорванной плазмидой pET28b.

    Одноцепочечные разрывы в природной ДНК не были нарушены Dps

    Очищенная плазмида pET28b выглядела как нативная и сильно скрученная молекула (фиг. 5A).Он расщеплялся сайт-специфической никазой Nt.BspD6I, которая распознавала девять последовательностей GAGTC и делала одноцепочечные разрывы в верхней цепи на четыре основания по направлению к 3’-концу [50]. В результате плазмида стала расслабленной и даже фрагментированной (рис. 5B), поскольку несколько сайтов связывания близко расположены в этой ДНК. Комплексы с Dps образуются при 5- и 10-кратном молярном избытке додекамеров Dps. Более высокое соотношение обеспечивало присутствие комплексов, образованных с разрезанной и неразрезанной ДНК, и позволяло обнаружить их различие, если таковое имеется, в то время как более низкое соотношение давало возможность увеличить долю комплексов, образованных с предпочтительными сайтами.Плотность связанных молекул Dps в 10-кратном избытке белка была выше на разорванной плазмиде по сравнению с нативной: 1 молекула на 117 ± 12 нм против 135 ± 23 нм соответственно (расчетная длина плазмиды 1917 нм). . Несмотря на то, что разница не была статистически значимой, она соответствовала ожидаемому вкладу зарубок. Однако бинарные комплексы с додекамерами Dps в обоих случаях были очень похожи, и тщательное исследование не выявило одноцепочечных хвостов вблизи связанного белка (рис. 5C и 5D).

    Рис. 5. Примеры нативной (A, C) и разорванной (B, D, E) плазмиды pET28b в свободном состоянии (A, B) и образующих комплексы с Dps (C-E) .

    Белые полосы изображения в масштабе (нм). Горизонтальные и вертикальные стрелки на панелях C-E указывают комплексы с более низким и более высоким уровнями олигомеризации соответственно.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g005

    Как в нативных, так и в разорванных образцах мы обнаружили приблизительно 15% комплексов, образованных с частицами Dps, меньшими, чем додекамеры (обозначены на рис. 5D горизонтальными стрелками).Следовательно, додекамерная форма не является абсолютно необходимой для взаимодействия с ДНК. Фрагментированные ДНК в большинстве случаев содержат молекулы Dps по крайней мере на одном конце двойной спирали. Таким образом, специфичное для конца взаимодействие с Dps не является специфическим свойством коротких линейных фрагментов ДНК. Образцы с разорванной плазмидой содержали в два раза больше комплексов, образованных с кажущимися агрегированными или каким-то образом перестроенными частицами Dps (30 и 15% соответственно), которые обычно были встроены в матрицу ДНК (вертикальные стрелки на рис. 5C – 5E).Хотя их детальная структура требует специального изучения, уже ясно, что этот способ связывания может вызывать значительные конформационные переходы в ДНК, поскольку сверхспиральный стержень, отчетливо видимый рядом с комплексом 3 (рис. 5E), скорее всего, не может образоваться в исходной плазмиде, имеющей прошли обработку никазой и пробоподготовку.

    Обсуждение

    Dps — основной белок бактериального нуклеоида, конденсирующий геном и защищающий его от различных повреждений во время устойчивого роста и при различных стрессах.Это означает, что взаимодействие с ДНК является фундаментальной биологической функцией этой молекулы. Решающая роль в связывании принадлежит остаткам лизина, расположенным в положениях 5, 8, 10 и 18 двенадцати N-концевых модулей [15]. Их положительный заряд обеспечивает способность связывать отрицательно заряженную ДНК так же, как гистоны в геномах эукариот. Однако, в отличие от октамера гистонов, сферическая поверхность Dps заряжена отрицательно (рис. 6А). Таким образом, остается загадкой, почему эволюция выбрала этот белок для защитного взаимодействия с ДНК.

    Рис. 6. Кристаллическая структура Dps (PDB ID: 1DPS) была получена с разрешением 1,6 Å Грантом и др. [16].

    Распределение заряда на поверхности Dps было рассчитано с использованием Swiss-PdbViewer версии 4.1.0 [52]. В панели [A] порог кулоновской окраски поверхности был установлен на -12 для красного (отрицательный электростатический потенциал), на -1,5 для белого и на 0 для синего (положительный потенциал). В панели [C] масштаб был изменен на: -12, -4,8 и 0 соответственно. N-конец цепи «А» был пропорционально удлинен, чтобы схематично показать расположение Lys 5 и Lys 8 (синие шарики).У двух других цепей N-концы удлинялись до положения 9 (как в цепи «А»). Серые звездочки в позиции [C] обозначают концы гибких модулей. Панель [B] показывает центральную пору и расположение субъединиц около одной и той же вершины. Панель [D] схематически иллюстрирует различные способы взаимодействия, включая связывание с разветвленной ДНК со структурой со скользящей петлей (слева), разорванной ДНК (две правые частицы) и прямой ДНК (вторая справа). В последнем случае два N-конца участвуют в связывании ДНК, а третий из той же вершины может связывать свободный сайт отрицательно заряженного пятна на поверхности другой молекулы Dps.Даже если такие контакты белок-белок могут образовываться в растворе, присутствие ДНК должно стабилизировать их и способствовать агрегации белка. Все размеры молекул на схеме указаны пропорционально натуральным размерам.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g006

    Комплексы с Dps были зарегистрированы для всех типов ДНК, протестированных в этом исследовании, и два новых способа связывания (концевое специфическое связывание и взаимодействие с разветвленной ДНК молекул).Поскольку линейные фрагменты ДНК (рис. 2) или усеченные ДНК (рис. 5) обычно имеют молекулы Dps на конце двойной спирали, мы предполагаем, что специфическое взаимодействие по концам более эффективно, чем связывание Dps с внутренними частями молекул ДНК. Однако искусственные триплексы обгоняли дуплексы в комплексообразовании с Dps (рис. 4, дорожки 1–3), по-видимому, прикрепляя его к внутренней части конструкции (рис. 3). Мы объяснили это предпочтение наличием сайта связывания для дополнительного N-конца в обеих новых мишенях.Поскольку в структуре додекамерных ДНК-связывающих модулей мономеров сгруппированы в триады (рис. 6В), трехстороннее соединение может быть особенно выгодным для образования комплекса, так же, как изогнутые и развернутые ДНК, включая частично расплавленные концы двойной ДНК. спиральные и одноцепочечные разрывы, тогда как взаимодействие с прямой ДНК может быть ограничено всего двумя контактами с N-концом. Если одноцепочечные разрывы являются мишенями для Dps, то уже известная способность этого белка уменьшать их количество в ответ на окислительный стресс [51] может быть опосредована не только физической защитой ДНК, но и его активным участием в связывании с такие дефекты.

    Хотя первые 21 аминокислотный остаток в каждой субъединице Dps неструктурированы, 13 из них можно проследить в рентгеновской структуре [16], используя в качестве прототипа полипептидную цепь «A» (обозначенную на фиг. 6B) [16]. Таким образом, очевидно, что неструктурированные N-концы довольно длинные и могут участвовать в электростатических взаимодействиях как с отрицательно заряженной ДНК, так и с отрицательно заряженной поверхностью белка. Т.е. они могут прилипать к белку за счет электростатических сил, как это наблюдалось для Dps A . tumefaciens [25] и могут не обнаруживаться в кристаллических структурах либо потому, что они гибкие, как принято считать, либо потому, что их контактные участки случайным образом распределены по всей доступной поверхности. Вот почему способность Dps агрегировать и образовывать олигомерные структуры является его внутренним свойством. Но эта способность в значительной степени стимулируется присутствием ДНК, а бинарные комплексы Dps-ДНК почти никогда не наблюдались в анализах смещения геля [1, 14, 19, 34, 39, 49]. Хорошо известно, что основными участниками этого процесса являются те же N-концевые лизины, которые связывают ДНК [15].Таким образом, было высказано предположение, что случайное связывание молекул Dps с ДНК ограничивает их подвижность в пространстве, тем самым увеличивая концентрацию белка в геноме и благоприятствуя межбелковым взаимодействиям [15, 18, 28]. Эта модель очень хорошо объясняет образование крупных агрегатов, часто наблюдаемых с помощью АСМ, но не может объяснить образование высокоупорядоченных двумерных решетчатых массивов [14, 29] и низкую способность свободных Dps агрегировать даже в очень высокой концентрации (см. Рис. 2A, например).Наши данные, подчеркивающие важность 3-кратной симметрии, позволили нам предложить другое объяснение сильной зависимости процесса агрегации от присутствия ДНК. Мы предполагаем, что в отсутствие ДНК N-концы Dps не являются полностью свободными. Вместо этого они случайным образом иммобилизуются на отрицательно заряженной поверхности белка. Три сильно заряженных пятна были обнаружены анализом поверхности с помощью Swiss-PdbViewer [52] (рис. 6C). Они расположены на удобном расстоянии от каждого N-конца, обеспечивая идеальную платформу для связывания, что снижает вероятность случайных внешних электростатических контактов.В присутствии ДНК один, два или три ДНК-связывающих модуля каждой вершины могут покинуть свои сайты связывания, освобождая их для контакта с N-концами других молекул Dps, если они расположены на доступном расстоянии. Две левые частицы на рис. 6D иллюстрируют эту ситуацию. То есть, с нашей точки зрения, присутствие ДНК стимулирует белок-белковые связи за счет перераспределения электростатических контактов. Те из них, которые стабилизировали целостность додекамера без ДНК, вызывают агрегацию в новых условиях.

    Способность Dps распознавать разветвленную двухцепочечную ДНК может иметь даже большее биологическое значение. В настоящее время известна только одна система в E . coli , которая распознает и обрабатывает такие разветвленные структуры, как соединения Холлидея. Эти четырехсторонние соединения образуются во время рекомбинации и репарации ДНК и разрешаются системой, состоящей из трех белков — RuvA, RuvB и RuvC, где октамерная геликаза RuvA специально «скульптурирована» для взаимодействия с крестообразной ДНК [53].Трехсторонние соединения могут быть образованы в любом сегменте ДНК, содержащем по крайней мере два прямых повтора, где могут быть сформированы два типа структур со скользящими петлями (SLS, проиллюстрированные на рис. 6D) [54]. В бактериальных геномах есть тысячи таких мест, включая кластеры регулярно расположенных коротких палиндромных повторов (CRISPR), принадлежащих бактериальной «иммунной» системе и тандемам сайтов связывания факторов транскрипции. В промоторной области гена dps , например, есть четыре пары коротких прямых повторов, две из которых перекрываются с первичным сайтом контакта для Dps (рис. 1B и 1C).Структурное состояние участков генома с тандемными повторами должно находиться под особым контролем клеточных регуляторных систем. Но система, эволюционно адаптированная для этой функции, еще не известна, и бактериальный Dps может быть предложен в качестве кандидата на эту функцию. Его сродство к 3-стороннему соединению и способность вызывать конформационные изменения в ДНК (рис. 1B, 3A и 5E) являются весомыми аргументами в пользу такой возможности. Однако способность Dps к агрегации, которая в основном важна для конденсации генома в стрессовых условиях, может мешать тонкому функционированию, необходимому для управления структурным ландшафтом в активном геноме.

    Есть один аспект, который также заслуживает некоторого внимания: если ДНК связана тремя N-концами одной вершины, что, как предполагается, является наиболее сильным способом взаимодействия, центральная пора белковой глобулы ведет во внутреннюю полость (рис. 6С), вплотную приближается к генетическому материалу. Даже небольшая утечка токсичных ионов железа из этой поры может быть разрушительной для целостности генома. Таким образом, вероятно, что, защищая ДНК от различных повреждающих агентов и удаляя токсичные ионы железа из геномной среды, Dps, возможно, также участвует в структурно-специфическом разрушении нуклеиновых кислот.

    В любом случае наши данные показали, что очищенный Dps E . coli собирается в стабильные додекамерные частицы с некоторым вкладом более мелких олигомеров. Взаимодействуя с ДНК, додекамерная форма Dps продемонстрировала определенную концевую специфичность и высокое сродство к трехстороннему соединению в искусственных молекулах ДНК. Поскольку связывание Dps с ДНК в основном осуществляется за счет электростатических взаимодействий, нет оснований исключать, что Dps также может образовывать комплексы с РНК, влияя на их функциональные свойства или стабильность, тем более что уже сообщалось, что «структуры кораллового рифа», образованные Dps2 М . smegmatis может разрушаться РНКазой А [55]. Таким образом, репертуар многофункционального белка Dps может быть даже шире, чем предполагалось в настоящее время.

    Благодарности

    Выражаем благодарность Геннадию Енину из Института исследования белков Российской академии наук (РАН) за то, что он поделился с нами своим опытом в АСМ в ходе исследования, и Надежде Зыриной из Института теоретических и экспериментальных исследований. Biophysics, РАН за любезное предоставление Nt.Никаза BspD6I.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: ONO SSA AAT. Проведены эксперименты: VVM USS MNT EVP DVB SSA. Проанализированы данные: ONO SSA AAT VGA. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: ONO SSA VGA. Написал статью: ONO SSA.

    Ссылки

    1. 1. Азам Т.А., Исихама А. Двенадцать видов нуклеоид-ассоциированного белка из Escherichia coli . Специфичность распознавания последовательности и аффинность связывания ДНК.J Biol Chem. 1999; 274: 33105–33113. pmid: 10551881
    2. 2. Дорман CJ. Связанные с нуклеоидами белки и физиология бактерий. Adv Appl Microb. 2009. 67: 47–64. pmid: 1

      36

    3. 3. Азам Т.А., Ивата А., Нишимура А., Уэда С., Исихама А. Зависящие от фазы роста изменения в белковом составе нуклеоида Escherichia coli . J Bacteriol. 1999; 181: 6361–6370. pmid: 10515926
    4. 4. Гудман С.Д., Фельтен Нью-Джерси, Гао К., Робинсон С., Сегал А.М. In vitro отбор сайтов связывания факторов хозяина интеграции. J Bacteriol. 1999; 181: 3246–3255. pmid: 10322029
    5. 5. Чо Б.К., Найт Э.М., Барретт К.Л., Палссон Б.О. Полногеномный анализ связывания Fis в Escherichia coli указывает на причинную роль A- / AT-трактов. Gen Res. 2008. 18: 900–910.
    6. 6. Чо Б.К., Барретт К.Л., Найт Э.М., Парк Ю.С., Палссон Б.О. Реконструкция в масштабе генома регуляторной сети Lrp в Escherichia coli .Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105: 19462–19467. pmid: 135
    7. 7. Bouffartiques E, Buckle M, Badaut C, Travers A, Rimsky S. Кооперативное связывание H-NS с сайтами с высоким сродством в регуляторном элементе приводит к подавлению транскрипции. Nat Struct Mol Biol. 2007. 14: 441–448. pmid: 17435766
    8. 8. Ueguchi C, Kakeda M, Yamada H, Mizumo T Аналог молекулярного шаперона DnaJ в Escherichia coli . Proc Nati Acad Sci USA. 1994; 91: 1054–1058.pmid: 8302830
    9. 9. Bloch V, Yang Y, Margeat E, Chavanieu A, Auge MT, Robert B et al. Домен димеризации H-NS определяет новую складку, способствующую распознаванию ДНК. Nat Struct Mol Biol. 2003. 10: 212–218.
    10. 10. Сонненфилд Дж. М., Бернс К. М., Хиггинс К. Ф., Хинтон Дж. Связанный с нуклеоидом белок StpA связывает изогнутую ДНК, имеет большую аффинность связывания ДНК, чем H-NS, и присутствует в значительных количествах у мутантов hns . Биохимия. 2001; 83: 243–249.pmid: 11278075
    11. 11. Боннефой Э, Такахаши М, Янив Ю.Р. Параметры связывания ДНК белка HU Escherichia coli с крестообразной ДНК. J Mol Biol. 1994; 242: 116–129. pmid: 8089835
    12. 12. Castaing B, Zelwer C, Laval J, Boiteux S. Белок HU Escherichia coli специфически связывается с ДНК, которая содержит одноцепочечные разрывы или разрывы. J Biol Chem. 1995; 270: 10291–10296. pmid: 7730334
    13. 13. Lavoie BD, Shaw GS, Millner A, Chaconas G.Анатомия комплекса флексер – ДНК внутри промежуточного транспозиции более высокого порядка. Клетка. 1996; 85: 761–771. pmid: 8646783
    14. 14. Альмирон М.А., Линк Дж., Ферлонг Д., Колтер Р. Новый ДНК-связывающий белок с регулирующими и защитными функциями в голодной Escherichia coli . Genes Dev. 1992; 6: 2646–2654. pmid: 1340475
    15. 15. Ceci P, Cellai S, Falvo E, Rivetti C, Rossi GL, Chiancone E. Конденсация ДНК и самоагрегация Escherichia coli Dps — это связанные явления, связанные со свойствами N-конца.Nucl Acids Res. 2004. 32: 5935–5944. pmid: 15534364
    16. 16. Грант Р.А., Фильм Диджей, Финкель С.Е., Колтер Р., Хогл Дж. М.. Кристаллическая структура Dps, гомолога ферритина, который связывает и защищает ДНК. Nat Struct Biol. 1998. 5: 294–303. pmid: 9546221
    17. 17. Де лос Риос С., Перона Дж. Дж. Структура Escherichia coli лейцин-чувствительный регуляторный белок Lrp обнаруживает новую октамерную сборку. J Mol Biol. 2007; 366: 1589–1602. pmid: 17223133
    18. 18.Сеси П., Илари А., Фалво Е., Джангиакомо Л., Чианконе Е. Повторная оценка стабильности белка, связывания ДНК и защиты Mycobacterium smegmatis Dps. J Biol Chem. 2005; 280: 34776–34785. pmid: 16030020
    19. 19. Рой С., Сарасвати Р., Чаттерджи Д., Виджаян М. Структурные исследования второго Mycobacterium smegmatis Dps: инвариантные и изменчивые особенности структуры, сборки и функции. J Mol Biol. 2008; 375: 948–959. Доступно: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17543333. pmid: 18061613
    20. 20. Юань Х.С., Финкель С.Е., Фенг Я.А., Качор-Гжесковяк М., Джонсон Р.С., Дикерсон Р.Э. Молекулярная структура белка FIS дикого типа и мутантного белка FIS: взаимосвязь между мутационными изменениями и функцией рекомбинационного энхансера или связыванием ДНК. Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 88: 9558–9562. pmid: 1946369
    21. 21. Кавамура Т., Вартанян А.С., Чжоу Х., Далквист Ф.В. Конструкция участвует в регуляции PapI и Lrp оперона pap.J Mol Biol. 2011; 409: 311–332. pmid: 21338611
    22. 22. Cordeiro TN, Schmidt H, Madrid C, Juarez A, Bernado P, Griesinger C. et al. Непрямое считывание ДНК белком, родственным H-NS: структура комплекса ДНК С-концевого домена Ler. Путь PLoS. 2011; 7: e1002380.
    23. 23. Райс ПА, Ян С.В., Мидзуучи К., Нэш Х.А. Кристаллическая структура комплекса ИГФ-ДНК: разворот ДНК, индуцированный белком. Клетка. 1996. 87: 1295–1306. pmid: 8980235
    24. 24. Стелла S, Cascio D, Johnson RC.Форма малой бороздки ДНК управляет связыванием ДНК-изгибающего белка Fis. Gen Dev. 2010; 24: 814–826.
    25. 25. Сеси П., Илари А., Фалво Е., Чианконе Е. Белок Dps Agrobacterium tumefaciens не связывается с ДНК, но защищает ее от окислительного расщепления: кристаллическая структура рентгеновского излучения, связывание железа и свойства улавливания гидроксильных радикалов. J Biol Chem. 2003; 278: 20319–20326. pmid: 12660233
    26. 26. Стиллман Т.Дж., Упадхьяй М., Норте В.А., Седельникова С.Е., Каррадус М., Цоков С.и другие. Кристаллические структуры белков Dps Lactococcus lactis MG1363 показывают присутствие N-концевой спирали, которая необходима для связывания ДНК. Mol Microbiol. 2005; 57: 1101–1112. pmid: 160

    27. 27. Чианконе Э., Сеси П. Многогранная способность белков Dps бороться с бактериальными стрессовыми состояниями: детоксикация железа и перекиси водорода и связывание ДНК. Biochim Biophys Acta. 2010; 1800: 798–805. pmid: 20138126
    28. 28. Ceci P, Mangiarotti L, Rivetti C, Chiancone E.Активирующий нейтрофилы белок Dps Helicobacter pylori , HP-NAP, использует механизм, отличный от Escherichia coli Dps, для связывания и конденсации ДНК. Nucl Acids Res. 2007. 35: 2247–2256. pmid: 17371778
    29. 29. Гупта С., Чаттерджи Д. Бимодальная защита ДНК ДНК-связывающим белком Mycobacterium smegmatis из клеток стационарной фазы. J Biol Chem. 2003. 278: 5235–5241. pmid: 12466274
    30. 30. Вольф С.Г., Френкиль Д., Арад Т., Финкель С.Е., Кольтер Р., Мински А.Защита ДНК путем биокристаллизации, вызванной стрессом. Природа. 1999; 400: 83–85. pmid: 10403254
    31. 31. Frenkiel-Krispin D, Levin-Zaidman S, Shimoni E, Wolf SG, Wachtel EJ, Arad T. et al. Регулируемые фазовые переходы бактериального хроматина: неферментативный путь общей защиты ДНК. EMBO J. 2001; 20: 1184–1191. pmid: 11230141
    32. 32. Френкиль-Криспин Д., Бен-Авраам И., Энгландер Дж., Шимони Э., Вольф С. Г., Мински А. Реструктуризация нуклеоидов у бактерий в стационарном состоянии.Mol Microbiol. 2004. 51: 395–405. pmid: 14756781
    33. 33. Азам Т.А., Хирага С., Исихама А. Два типа локализации ДНК-связывающих белков в нуклеоиде Escherichia coli . Гены клеток. 2000. 5: 613–626. pmid: 10947847
    34. 34. Френкил-Криспин Д., Мински А. Нуклеоидная организация и поддержание целостности ДНК в E . coli , B . subtilis и D . радиодуранс .J Struct Biol. 2006; 156: 311–319. pmid: 16935006
    35. 35. Huergo LF, Rahman H, Ibrahimovic A, Day CJ, Korolika V. Campylobacter jejuni Белок Dps связывает ДНК в присутствии железа или перекиси водорода. J Bacteriol. 2013; 195: 1970–1978. pmid: 23435977
    36. 36. Зет К. Биоминерализирующие белки Dps: многофункциональные архитекторы природы. Биохим Дж. 2012; 445: 297–311. pmid: 22788214
    37. 37. Salgado H, Peralta-Gil M, Gama-Castro S, Santos-Zavaleta A, Muñiz-Rascado L, García-Sotelo JS.и другие. RegulonDB v8.0: наборы данных omics, эволюционное сохранение, нормативные требования, перекрестно проверенные золотые стандарты и многое другое. Nucl Acids Res. 2013; 41 (Выпуск базы данных): D203–213. pmid: 23203884
    38. 38. Calhoun LN, Kim JN, Ren Y, Song JJ, Kwon YM. ДНК-связывающий белок Dps функционирует в качестве глобального регулятора при голодании Salmonella enterica сероварном энтеридите во время голодания. Int J Microb Res. 2011; 3: 136–147. http://dx.doi.org/10.9735/0975-5276.3.3.136-147.
    39. 39.Пуртов Ю.А., Глазунова О.А., Антипов С.С., Покусаева В.О., Фесенко Е.Е., Преображенская Е.В. и другие. Промоторные острова как платформа для взаимодействия с нуклеоидными белками и факторами транскрипции. J Bioinform Comput Biol. 2014; 12: 1441006. pmid: 24712533 ​​
    40. 40. Ilari A, Ceci P, Ferrari D, Rossi GL, Chiancone E. Инкорпорация железа в Escherichia coli Dps дает ферритиноподобное микрокристаллическое ядро. J Biol Chem. 2002; 277: 37619–37623. pmid: 12163499
    41. 41.Ивахори К., Эномото Т., Фурушо Х., Миура А., Нишио К., Мисима Ю. и др. Синтез наночастиц сульфида кадмия в белке Dps из Listeria innocua . Chem Mater. 2007. 19: 3105–3111.
    42. 42. Игараси К., Исихама А. Двудольная функциональная карта E . coli альфа-субъединица РНК-полимеразы: участие С-концевой области в активации транскрипции с помощью цАМФ-CRP. Клетка. 1991; 65: 1015–1022. pmid: 1646077
    43. 43. Тутукина М.Н., Шавкунов К.С., Масулис И.С., Озолин О.Н.Антисмысловая транскрипция в локусе hns Escherichia coli . Мол Биол (Моск). 2010. 44: 439–447. pmid: 20608167
    44. 44. Маниатис Т., Фриш Э. Ф., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. Нажмите; 1982.
    45. 45. Рогулин Е.А., Перевязова Т.А., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. Плазмида pRARE как вектор для клонирования с целью конструирования суперпродуцента сайт-специфической никазы N.BspD6I.Биохимия (Москва). 2004. 69: 1123–1127. pmid: 15527412
    46. 46. Антипов С.С., Покусаева В.О., Мелехов В.В., Озолин О.Н. Зависимость образования нуклеопротеидных комплексов с белком Dps от физико-химических свойств ДНК. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2013; 7: 24–28. Доступно: http://www.radiotec.ru/catalog.php?cat=jr19&art=13161
    47. 47. Altuvia S, Almiron M, Huisman G, Kolter R, Storz G. Промотор dps активируется OxyR во время роста и IHF и σ S в стационарной фазе.Mol Microbiol. 1994; 13: 265–272. pmid: 7984106
    48. 48. Lacour S, Landini P. Экспрессия сигмаS-зависимых генов в начале стационарной фазы в Escherichia coli : функция сигмаS-зависимых генов и идентификация их промоторных последовательностей. J Bacteriol. 2004; 186: 7186–7195. pmid: 15489429
    49. 49. Швырева У.С., Тутукина М.Н., Озолин О.Н. Бактериоферритин: свойства, структурная и функциональная организация регуляторной области гена dps .Биофизика. 2011; 56: 795–802.
    50. 50. Мачулин А.В., Дерюшева В.И., Юнусова А.К., Железная Л.А., Сердюк И.Н. Исследование сайт-специфического связывания ДНК с никелирующей эндонуклеазой Nt.BspD6I на уровне одной молекулы с помощью атомно-силовой микроскопии. Биофизика. 2012; 57: 314–317.
    51. 51. Мартинес А., Колтер Р. Защита ДНК во время окислительного стресса с помощью неспецифического ДНК-связывающего белка Dps. J Bacteriol. 1997; 179: 5188–5194. Доступно: http://jb.asm.org/content/179/16/5188.full.pdf + html. pmid: 63
    52. 52. Guex N, Peitsch MC. SWISS-MODEL и Swiss-PdbViewer: среда для сравнительного моделирования белков. Электрофорез. 1997; 18: 2714–2723. pmid: 9504803
    53. 53. Инглстон С.М., Дикман М.Дж., Грасби Д.А., Хорнби Д.П., Шарплс Г.Дж., Ллойд Р.Г. Связывание и процессинг холлидей-соединения белком RuvA Mycoplasma pneumoniae . Eur J Biochem. 2002; 269: 1525–1533. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11874468.pmid: 11874468
    54. 54. Хомякова Е.Б., Петрова М.В., Минят Э.Е., Иванов В.И. Структура ДНК со скользящей петлей: конкретная нуклеотидная последовательность образует только один уникальный конформер. Письма FEBS. 1998. 422: 265–268. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/94

      . pmid: 94

    55. 55. Гхатак П., Кармакар К., Касетти С., Чаттерджи Д. Раскрытие роли Dps в организации микобактериальных нуклеоидов. PLoS ONE. 2011; 6: e16019. pmid: 21283627

    Два предполагаемых гена аквапоринов по-разному экспрессируются во время арбускулярного микоризного симбиоза у Lotus japonicus | BMC Plant Biology

  • 1.

    Bonfante P, Anca I-A: Растения, микоризные грибы и бактерии: сеть взаимодействий. Annu Rev Microbiol. 2009, 63: 363-383.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 2.

    Поррас-Альфаро А., Байман П.: Скрытые грибы, эмерджентные свойства: эндофиты и микробиомы. Анну Рев Фитопатол. 2011, 49: 291-315.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 3.

    Берендсен Р.Л., Калхове НИЦ, Лугонес Л.Г., Wösten HAB, Баккер ПАУМ: прорастание Lecanicillium фунгикола в микосфере Agaricus bisporus. Environ Microbiol Rep.2012, 4: 227-233.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 4.

    Smith SE, Smith FA: Свежие взгляды на роль арбускулярных микоризных грибов в питании и росте растений. Mycologia. 2012, 104: 1-13.

    PubMed Статья Google ученый

  • 5.

    Maillet F, Poinsot V, Andre O, Puech-Pages V, Haouy A, Gueunier M, Cromer L, Giraudet D, Formey D, Niebel A, Martinez EA, Driguez H, Becard G, Denarie J: симбиотические сигналы грибковых липохитоолигосахаридов в арбускулярная микориза. Природа. 2011, 469: 58-63.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 6.

    Бонфанте П., Рекена Н.: Свидания в темноте: как корни реагируют на сигналы грибов, чтобы установить арбускулярный микоризный симбиоз.Curr Opin Plant Biol. 2011, 14: 451-457.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 7.

    Александр Т., Тот Р., Мейер Р., Вебер Х.С.: Динамика развития и дегенерации арбускул у лука, фасоли и томатов применительно к везикулярно-арбускулярной микоризе в травах. Может J Bot. 1989, 67: 2505-2513.

    Артикул Google ученый

  • 8.

    Жанр А, Иванов С., Фендрих М., Фаччио А., Дарски В., Бисселинг Т., Бонфанте П. Множественные экзоцитотические маркеры накапливаются в местах биогенеза перифунгальной мембраны при арбускулярных микоризах.Physiol растительных клеток. 2012, 53: 244-255.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 9.

    Pumplin N, Zhang X, Noar RD, Harrison MJ: Полярная локализация специфичного для симбиоза транспортера фосфата опосредуется временной переориентацией секреции. PNAS. 2012, 109: E665-E672.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 10.

    Hohnjec N, Vieweg MF, Pühler A, Becker A, Küster H: перекрытия в профилях транскрипции корней Medicago truncatula, инокулированных двумя разными грибами Glomus, дают представление о генетической программе, активируемой во время арбускулярной микоризы. Plant Physiol. 2005, 137: 1283-1301.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 11.

    Güimil S, Chang HS, Zhu T, Sesma A, Osbourn A, Roux C, Ioannidis V, Oakeley EJ, Docquier M, Descombes P, Briggs SP, Paszkowski U: Сравнительная транскриптомика риса показывает древний образец реакции на микробную колонизацию.PNAS. 2005, 102: 8066-8070.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 12.

    Лю Дж., Мальдонадо-Мендоса I, Лопес-Мейер М., Чунг Ф, Таун С.Д., Харрисон М.Дж .: Арбускулярный микоризный симбиоз сопровождается локальными и системными изменениями экспрессии генов и увеличением устойчивости побегов . Плант Дж. 2007, 50: 529-544.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 13.

    Fiorilli V, Catoni M, Miozzi L, Novero M, Accotto GP, Lanfranco L: Профили экспрессии генов глобального и клеточного типа в растениях томата, колонизированных арбускулярным микоризным грибом. Новый Фитол. 2009, 184: 975-987.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 14.

    Guether M, Balestrini R, Hannah M, He J, Udvardi MK, Bonfante P: Общегеномное перепрограммирование регуляторных сетей, транспорта, клеточной стенки и биогенеза мембран во время арбускулярного микоризного симбиоза в Lotus japonicus.Новый Фитол. 2009, 182: 200-212.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 15.

    Hogekamp C, Arndt D, Pereira P, Becker JD, Hohnjec N, Küster H: лазерная микродиссекция раскрывает специфическую транскрипцию клеточного типа в корнях арбускулярной микоризы, включая экспрессию генов TF CAAT-box, коррелирующую с контактом с грибами и распространять. Plant Physiol. 2011, 157: 2023-2043.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 16.

    Gaude N, Bortfeld S, Duensing N, Lohse M, Krajinski F: Арбускул-содержащие и неколонизированные кортикальные клетки микоризных корней подвергаются обширному и специфическому репрограммированию во время развития арбускулярной микоризы. Плант Дж. 2012, 69: 510-528.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 17.

    Sanchez L, Weidmann S, Brechenmacher L, Batoux M, Van Tuinen D, Lemanceau P, Gianinazzi S, Gianinazzi-Pearson V: Общая экспрессия генов в корнях Medicago truncatula в ответ на колонизацию Pseudomonas fluorescens, развитие микоризы узловатость.Новый Фитол. 2004, 2004: 855-863.

    Артикул Google ученый

  • 18.

    Küster H, Hohnjec N, Krajinski F, El Yahyaoui F, Manthey K, Gouzy J, Dondrup M, Meyer F, Kalinowski J, Brechenmacher L, van Tuinen D, Gianinazzi-Pearson V, Pühler A, Gamas П., Беккер А. Создание и проверка основанных на кДНК макро- и микрочипов Mt6k-RIT для изучения эндосимбиоза корней в модельной бобовой Medicago truncatula. J Biotechnol. 2004, 108: 95-113.

    PubMed Статья Google ученый

  • 19.

    Gutjahr C, Banba M, Croset V, An K, Miyao A, An G, Hirochika H, ​​Imaizumi-Anraku H, Paszkowski U: Передача сигналов, специфичных для арбускулярной микоризы, в рисе выходит за пределы общего пути передачи сигналов симбиоза. Растительная клетка. 2008, 20: 2989-3005.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 20.

    Агре П., Козоно Д.: Водные каналы аквапоринов: молекулярные механизмы заболеваний человека.FEBS Lett. 2003, 555: 72-78.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 21.

    Kaldenhoff R, Fischer M: Аквапорины в растениях. Acta Physiologica. 2006, 187: 169-176.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 22.

    Форрест К.Л., Бхаве М: Основные внутренние белки (MIP) в растениях: сложное семейство генов, оказывающее большое влияние на фенотип растений.Funct Integr Genomics. 2007, 7: 263-289.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 23.

    Maurel C, Verdoucq L, Luu D-T, Santoni V: Plant Aquaporins: мембранные каналы с множеством интегрированных функций. Annu Rev Plant Biol. 2008, 59: 595-624.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 24.

    Gupta AB, Verma RK, Agarwal V, Vajpai M, Bansal V, Sankararamakrishnan R: MIPModDB: центральный ресурс для суперсемейства основных внутренних белков.Nucleic Acids Res. 2012, 40: D362-D369.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 25.

    Chaumont F, Moshelion M, Daniels MJ: Регулирование активности аквапоринов растений. Biol Cell. 2005, 97: 749-764.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 26.

    Ма Дж. Ф., Ямаджи Н.: Функции и транспорт кремния в растениях. Cell Mol Life Sci.2008, 65: 3049-3057.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 27.

    Лю К., Ван Х, Чжан З, Ву Дж, Фэн Й, Чжу З .: Расхождение в функции и экспрессии внутренних белков, подобных NOD26, в растениях. BMC Genomics. 2009, 10: 313.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 28.

    Danielson J, Johanson U: Неожиданная сложность семейства генов Aquaporin у мха Physcomitrella patens.BMC Plant Biol. 2008, 8:45.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 29.

    Gomes D, Agasse A, Thiébaud P, Delrot S, Gerós H, Chaumont F: Аквапорины — это многофункциональные переносчики воды и растворенных веществ, которые сильно различаются в живых организмах. Biochim Biophys Acta. 2009, 1788: 1213-1228.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 30.

    Круз Э., Улейн Н., Калденхофф Р.: Аквапорины. Genome Biol. 2006, 7: 206.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 31.

    Руис-Лозано Дж. М., Арока Р.: Симбиоз и стресс. 2010, Нидерланды: Springer, 357-374. 17

    Google ученый

  • 32.

    Bárzana G, Aroca R, Paz JA, Chaumont F, Martinez-Ballesta MC, Carvajal M, Ruiz-Lozano JM: Симбиоз арбускулярного микориза увеличивает относительный апопластический поток воды в корнях растения-хозяина при обоих поливах. и стрессовые условия засухи.Энн Бот. 2012, 109: 1009-1017.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 33.

    Uehlein N, Fileschi K, Eckert M, Bienert GP, Bertl A, Kaldenhoff R: Арбускулярный микоризный симбиоз и экспрессия растительного аквапорина. Фитохимия. 2007, 68: 122-129.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 34.

    Bienert GP, Bienert MD, Jahn TP, Boutry M, Chaumont F: Solanaceae XIPs представляют собой аквапорины плазматической мембраны, которые облегчают транспорт многих незаряженных субстратов.Плант Дж. 2011, 66: 306-317.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 35.

    Javot H, Penmetsa RV, Terzaghi N, Cook DR, Harrison MJ: переносчик фосфата Medicago truncatula, необходимый для арбускулярного микоризного симбиоза. Proc Natl Acad Sci USA. 2007, 104: 1720-1725.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 36.

    Neuhäuser B, Dynowski M, Mayer M, Ludewig U: Регулирование транспорта Nh5 + посредством существенных перекрестных помех между мономерами amt через карбоксильные хвосты. Plant Physiol. 2007, 143: 1651-1659.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 37.

    Людвиг У., Диновски М.: Селективность растений по аквапорину: там, где встречаются транспортные анализы, компьютерное моделирование и физиология. Cell Mol Life Sci. 2009, 66: 3161-3175.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 38.

    Guttenberger M: Арбускулы везикулярно-арбускулярных микоризных грибов обитают в кислой среде корней растений. Planta. 2000, 211: 299-304.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 39.

    Лю Л. Х., Людвиг Ю., Гассерт Б., Фроммер В. Б., фон Вирен Н.: Транспорт мочевины с помощью регулируемых азотом внутренних белков тонопласта у арабидопсиса. Plant Physiol. 2003, 133: 1220-1228.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 40.

    Otto B, Uehlein N, Sdorra S, Fischer M, Ayaz M, Belastegui-Macadam X, Heckwolf M, Lachnit M, Pede N, Priem N, Reinhard A, Siegfart S, Urban M, Kaldenhoff R: состав тетрамера Aquaporin изменяет функция аквапоринов табака. J Biol Chem. 2010, 285: 31253-31260.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 41.

    Bonfante P, Жанр A: Механизмы, лежащие в основе полезных взаимодействий растений и грибов в микоризном симбиозе.Nat Commun. 2010, 1: 48.

    PubMed Статья Google ученый

  • 42.

    Fortin MG, Morrison NA, Verma DPS: Nodulin-26, нодулин перибактероидной мембраны экспрессируется независимо от развития перибактероидного компартмента. Nucl Acids Res. 1987, 15: 813-824.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 43.

    Liu Q, Zhu Z: Функциональная дивергенция белков подгруппы NIP III связана с измененными селективными ограничениями и положительным отбором.BMC Plant Biol. 2010, 10: 256.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 44.

    Lopez D, Bronner G, Brunel N, Auguin D, Bourgerie S, Brignolas F, Carpin S, Tournaire-Roux C, Maurel C, Fumanal B, Martin F, Sakr S, Label P, Julien JL, Gousset-Dupont A, Venisse JS: Взгляд на аквапорины Populus XIP: эволюционное расширение, функциональность белка и регулирование окружающей среды. J Exp Bot. 2012, 63: 2217-2230.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 45.

    Dietz S, von Bülow J, Beitz E, Nehls U: Семейство генов аквапоринов эктомикоризного гриба Laccaria bicolor: уроки симбиотических функций. Новый Фитол. 2011, 190: 927-940.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 46.

    Гюнтер Дж. Ф., Робертс Д. М.: Водоселективные и многофункциональные аквапорины из клубеньков Lotus japonicus.Planta. 2000, 210: 741-748.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 47.

    Харрисон М.Дж., Девбре Г.Р., Лю Дж .: переносчик фосфата из Medicago truncatula, участвующий в приобретении фосфата, выделяемого арбускулярными микоризными грибами. Растительная клетка Интернет. 2002, 14: 2413-2429.

    CAS Статья Google ученый

  • 48.

    Kobae Y, Hata S: Динамика периарскулярных мембран, визуализированная с помощью флуоресцентного переносчика фосфата в корнях арбускулярной микоризы риса.Physiol растительных клеток. 2010, 51: 341-353.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 49.

    Pumplin N, Harrison MJ: Визуализация живых клеток выявляет периарбускулярные мембранные домены и расположение органелл в корнях Medicago truncatula во время арбускулярного микоризного симбиоза. Plant Physiol. 2009, 151: 809-819.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 50.

    Bonfante P: Растительно-грибковые взаимодействия в микоризах. Энциклопедия наук о жизни. 2010, Великобритания: John Wiley & Sons, Ltd.

    Google ученый

  • 51.

    Mizutani M, Watanabe S, Nakagawa T., Maeshima M: Aquaporin NIP2; 1 в основном локализуется на мембране ER и демонстрирует специфическое для корней накопление у Arabidopsis thaliana. Physiol растительных клеток. 2006, 47: 1420-1426.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 52.

    Kobae Y, Tamura Y, Takai S, Banba M, Hata S: Локальная экспрессия арбускулярных переносчиков аммония, индуцируемых микоризой, в сое. Physiol растительных клеток. 2010, 51: 1411-1415.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 53.

    Bonfante P, Perotto S: Tansley Review No. 82. New Phytol. 1995, 130: 3-21.

    Артикул Google ученый

  • 54.

    Джанинацци-Пирсон V: Ответы растительных клеток на арбускулярные микоризные грибы: добраться до корней симбиоза.Растительная клетка онлайн. 1996, 8: 1871-1883.

    Артикул Google ученый

  • 55.

    Харрисон MJ: Молекулярные и клеточные аспекты арбускулярного микоризного симбиоза. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1999, 50: 361-389.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 56.

    Lehto T, Zwiazek J: Эктомикориза и водные отношения деревьев: обзор.Микориза. 2011, 21: 71-90.

    PubMed Статья Google ученый

  • 57.

    Broughton WJ, Dilworth MJ: Контроль синтеза леггемоглобина в змеиной фасоли. Biochem J. 1971, 125: 1075-1080.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 58.

    Guether M, Neuhäuser B, Balestrini R, Dynowski M, Ludewig U, Bonfante P: микоризный переносчик аммония из Lotus japonicus получает азот, выделяемый арбускулярными микоризными грибами.Plant Physiol. 2009, 150: 73-83.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 59.

    Guether M, Volpe V, Balestrini R, Requena N, Wipf D, Bonfante P: LjLHT1.2 — индуцируемый микоризой переносчик растительных аминокислот из Lotus japonicus. Биол плодородные почвы. 2011, 47: 925-936.

    CAS Статья Google ученый

  • 60.

    Marini AM, Soussi-Boudekou S, Vissers S, Andre B: Семейство переносчиков аммония в Saccharomyces cerevisiae.Mol Cell Biol. 1997, 17: 4282-4293.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 61.

    Bertl A, Kaldenhoff R: Функция отдельной поры Nh4 в Aquaporin TIP2; 2 из пшеницы. FEBS Lett. 2007, 581: 5413-5417.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 62.

    Бертл А., Слейман К.Л., Градманн Д. Стробирование и проводимость в выпрямляющем наружу канале K + от плазматической мембраны Saccharomyces cerevisiae.J Membr Biol. 1993, 132: 183-199.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 63.

    Balestrini R, Gómez-Ariza J, Lanfranco L, Bonfante P: Лазерная микродиссекция показывает, что транскрипты для пяти генов переносчиков фосфата растений и одного грибка одновременно присутствуют в арбускулярных клетках. Mol Plant Microbe Interactive. 2007, 20: 1055-1062.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 64.

    Yoo S-D, Cho Y-H, Sheen J: Протопласты мезофилла Arabidopsis: универсальная клеточная система для анализа временной экспрессии генов. Протоколы Nat. 2007, 2: 1565-1572.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 65.

    Карими М., Инзе Д., Депикер А: векторы GATEWAY для опосредованной Agrobacterium трансформации растений. Trends Plant Sci. 2002, 7: 193-195.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 66.

    Limpens E, Mirabella R, Fedorova E, Franken C, Franssen H, Bisseling T., Geurts R: Формирование органеллоподобных N2-фиксирующих симбиосом в клубеньках корня бобовых контролируется DMI2. Proc Natl Acad Sci USA. 2005, 102: 10375-10380.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    • Электронные тендеры DAE | Открытые тендеры | Оффлайн тендеры | Интернет-конкурсы

    РАЗДЕЛ A 1. ЦЕНА ЦЕНЫ, УКАЗАННЫЕ В НАСТОЯЩЕМ ЗАКАЗЕ НА ПОКУПКУ, ПРЕДНАЗНАЧЕНЫ ДЛЯ БЕСПЛАТНОЙ БЕЗОПАСНОЙ ДОСТАВКИ ТОВАРОВ ПОЛУЧАТЕЛЮ, НО ЭТИ ЦЕНЫ НЕ ВКЛЮЧАЮТ КАКИЕ-ЛИБО ПОШЛИНЫ ОКТРОЙ.ПОКУПАТЕЛЬ ПРЕДОСТАВЛЯЕТ ПОДРЯДЧИКУ СВИДЕТЕЛЬСТВО ОБ ОСВОБОЖДЕНИИ ОТБОЙ ОТ ОБЯЗАННОСТЕЙ OCTROI НА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОСВОБОЖДЕНИЯ ОТ ОБЯЗАННОСТИ OCTROI. ПРИНЯТЫЕ ЦЕНЫ ОСТАВЛЯЮТСЯ ФИРМОЙ В ТЕЧЕНИЕ ВАЛЮТЫ ДОГОВОРА.

    2. НАЛОГ НА ДОБАВЛЕННУЮ СТОИМОСТЬ НДС (НАЛОГ НА ДОБАВЛЕННУЮ СТОИМОСТЬ) ДОЛЖЕН УПЛАЧИТЬСЯ ДОПОЛНИТЕЛЬНО В ТЕЧЕНИЕ СРОКА ПОСТАВКИ, УКАЗАННОГО В ЗАКАЗЕ НА ПОКУПКУ. НАСТОЯЩАЯ СТАВКА НДС ДЛЯ ПУНКТА № 1 И @ 13,5% ДЛЯ ПУНКТА № 2 ПОДРЯДЧИК ДОЛЖЕН ПРЕДСТАВИТЬ СВИДЕТЕЛЬСТВО ПО СЧЕТУ В ОТНОШЕНИИ ДОБАВЛЕННОЙ СТОИМОСТИ НАЛОГА, КАК В ПРИЛОЖЕНИИ «А» ПРИЛОЖЕНИЕ.

    3. OCTROI ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ОТДЕЛЕНИИ АТОМНОЙ ЭНЕРГИИ И ЕГО ПРОЕКТНЫЕ И СОСТАВЛЯЮЩИЕ ЕДИНИЦЫ ОСВОБОЖДАЮТСЯ ОТ ОПЛАТЫ ПОШЛИНА OCTROI. КОГДА ОТПРАВЛЯЕМЫЙ ДОРОГАМИ, ПОДРЯДЧИК НЕ ДОЛЖЕН УКАЗАТЬ НАИМЕНОВАНИЕ ПОЛУЧАТЕЛЯ В КВИТАНЦИИ НА ГРУЗИНУ КАК «САМ», И НАИМЕНОВАНИЕ ПОЛУЧАТЕЛЯ В ПОЛУЧЕНИИ ДОЛЖНО БЫТЬ ТО, ЧТО УКАЗАНО В НАСТОЯЩЕМ ЗАКАЗЕ НА ПОКУПКУ. ПОДРЯДЧИК ОБЯЗАН ПОЛУЧИТЬ ОТ ПОКУПАТЕЛЯ НЕОБХОДИМОЕ КОЛИЧЕСТВО СЕРТИФИКАТА ОТКАЗА ОТ ОБЯЗАННОСТЕЙ OCTROI И ПЕРЕДАТЬ ИХ ТРАНСПОРТНОМУ ПОДРЯДЧИКУ ВМЕСТЕ С КОНТРАГЕНТОМ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСПОРТНОГО ПОДРЯДЧИКА КОНТРАГЕНТ И ИСКАТЬ ОСВОБОЖДЕНИЕ ОТ ПОШЛИНЫ OCTROI.КОНКРЕТНОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ «ПОЛУЧЕН СЕРТИФИКАТ ОБЯЗАННОСТЕЙ OCTROI» ДОЛЖЕН БЫТЬ ВКЛЮЧЕН В ПОЛУЧЕННЫЙ ОТ ТРАНСПОРТНОГО ПОДРЯДЧИКА КОНТРАГЕНТ ВО ВРЕМЯ ПЕРЕДАЧИ ДОГОВОРА, НЕСМОТРЯ НА ПРАВО ПЕРЕВОЗКИ КОНТРОЛЯ. ПОКУПАТЕЛЮ ДО ОТПРАВКИ. ПОСКОЛЬКУ ЭТО ПОДХОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ, НЕВОЗМОЖНО ВЫПУСКАТЬ ЛЮБЫЕ ДВОЙНЫЕ ИЛИ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ НАБОРЫ В СЛУЧАЕ ЕГО НЕПРАВИЛЬНОГО ПОМЕЩЕНИЯ ИЛИ ПОВРЕЖДЕНИЯ, ПОЭТОМУ ПОДРЯДЧИК ДОЛЖЕН ОБРАТИТЬСЯ С ДОЛЖНЫМ ОБРАЗОМ И ВНИМАНИЕ, ЧТОБЫ УБЕДИТЬСЯ, ЧТО СЕРТИФИКАЦИЯ ПРЕДОСТАВЛЯЕТ ЕГО СЕРТИФИКАЦИЮ.ПОДРЯДЧИК НЕСЕТ ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ЗА ВОЗВРАТ НЕИСПОЛЬЗОВАННОГО КОМПЛЕКТА СЕРТИФИКАТА ОБ ОСВОБОЖДЕНИИ ПОШЛИН OCTROI ПОКУПАТЕЛЮ. В СЛУЧАЕ НЕОБХОДИМО ОТПРАВИТЬ БОЛЕЕ ОДНОГО ЗАПРОСА И ПОДРЯДЧИК ТРЕБУЕТСЯ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ КОМПЛЕКТ СЕРТИФИКАТОВ OCTROI ОБ ОСВОБОЖДЕНИИ ОБЯЗАННОСТЕЙ, ПОДРЯДЧИК ДОЛЖЕН ОТПРАВИТЬ ПИСЬМЕННЫЙ ЗАПРОС ПОКУПАТЕЛЮ, УКАЗЫВАЮЩИЙ НЕОБХОДИМОСТЬ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ ДОБАВЛЕНИЙ. ОДИН КОМПЛЕКТ СЕРТИФИКАТОВ OCTROI ОБ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПОДШИПНИКОВ С СЕРИЙНЫМ НОМЕРОМ 86982 ПРИКЛЮЧЕН СЮДА

    4.ЗАЛОГ БЕЗОПАСНОСТИ В СООТВЕТСТВИИ С СТАТЬЕЙ № 4 DPS-P-11 ПОСТАВЩИК ПРЕДОСТАВЛЯЕТ ЗАЛОГ НА 10% ОТ МАТЕРИАЛЬНОЙ СТОИМОСТИ I.E. RS. 59,324 / — ЦЕННЫЙ ДЕПОЗИТ ПРЕДОСТАВЛЯЕТСЯ В ФОРМЕ БАНКОВСКОЙ ГАРАНТИИ, ПРЕДНАЗНАЧЕННОЙ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ОТ ГОСУДАРСТВЕННОГО БАНКА ИНДИИ ИЛИ ЛЮБОГО ИЗ НАЦИОНАЛИЗОВАННЫХ БАНКОВ ИЛИ УКАЗАННЫХ ЧАСТНЫХ БАНКОВ ICICI ИЛИ HDFC ИЛИ AXIS ИЛИ IDBIAMP СООТВЕТСТВУЮЩЕЙ СТОИМОСТИ В ФОРМЕ И СПОСОБЕ, ДОПУСТИМЫХ ДЛЯ ПОКУПАТЕЛЯ (ФОРМАТ БАНКОВСКОЙ ГАРАНТИИ ПРИЛОЖЕН).БАНКОВСКАЯ ГАРАНТИЯ ДЕЙСТВУЕТ ДО ОКОНЧАНИЯ ПРИЕМКИ ТОВАРА ПОКУПАТЕЛЕМ. ЗАЛОГ ОБЕСПЕЧИВАЕТСЯ В ТЕЧЕНИЕ 15 ДНЕЙ С ДАТЫ ПОЛУЧЕНИЯ ДОГОВОРА. ПОЖАЛУЙСТА, ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ, ЧТО ДЕПОЗИТ В ОБЛАСТИ БУДУЩИХ БУДЕТ ЗАКЛЮЧЕН ИЗ-ЗА НЕСОБЛЮДЕНИЯ ЛЮБОГО ИЗ УСЛОВИЙ ДАННОГО ЗАКАЗА.

    5. ГРАФИК ПОСТАВКИ ПРЕДМЕТЫ, ПРЕДОСТАВЛЯЕМЫЕ НАСТОЯЩИМ ЗАКАЗОМ НА ПОКУПКУ, ДОЛЖНЫ БЫТЬ ДОСТАВЛЕНЫ В ТЕЧЕНИЕ 90 ДНЕЙ С ДАТЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАКАЗА I.E. НА ИЛИ ДО ДАТЫ ПОСТАВКИ, УКАЗАННОЙ В ТЕКСТЕ ЗАКАЗА НА ПОКУПКУ. В СЛУЧАЕ, ЕСЛИ ПОДРЯДЧИК НЕ МОЖЕТ ДОСТАВИТЬ ТОВАРЫ ПО ГРАФИКУ ПОСТАВКИ, ПРЕДУСМОТРЕННОМ В НАСТОЯЩЕМ ЗАКАЗЕ, ОБЯЗАТЕЛЬНО С ЕГО СТОРОНОЙ ОБЯЗАТЕЛЬНО ПОДХОДИТЕ К ЭКСПЛУАТАЦИИ ПОКУПАТЕЛЯ. СРОК ПОСТАВКИ С ОБОСНОВАНИЕМ ЗАДЕРЖКИ ДЛЯ РАССМОТРЕНИЯ ПОКУПАТЕЛЯ. ПОДРЯДЧИК ДОЛЖЕН ДОСТАВИТЬ ТОВАР ТОЛЬКО ПОСЛЕ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДЛЕННОГО ПОКУПАТЕЛЕМ СРОКА ПОСТАВКИ. В СЛУЧАЕ, ЧТО ПОДРЯДЧИК НЕ СОБЛЮДАЕТ НАСТОЯЩЕЕ УСЛОВИЕ И ПОСТАВЛЯЕТ ТОВАР ПОЛУЧАТЕЛЮ ПОСЛЕ истечения СРОКА ПОСТАВКИ, НЕ ДОСТУПНО ПРОДЛЕННОГО СРОКА ПОСТАВКИ, ПОЛУЧАТЕЛЬ НЕ ПОЛУЧИТ ТОЛЬКО ТОВАР, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДОСТАВКОЙ ЛЮБОЕ, отправленное ПОДРЯДЧИКОМ ПЛАТЕЖНОМУ ОРГАНУ, БУДЕТ ВОЗВРАЩАТЬСЯ ПОСТАВЩИКАМ БЕЗ КАКИХ-ЛИБО ОТВЕТСТВЕННОСТИ И ОБЯЗАТЕЛЬСТВ СО СТОРОНЫ ПОКУПАТЕЛЯ.ЭТО НИКОГДА НЕ ПРЕДПОЧИТАЕТ ДРУГИЕ ПРАВА ПОКУПАТЕЛЯ В СООТВЕТСТВИИ С УСЛОВИЯМИ ЗАКАЗА.

    6. ПОЛУЧАТЕЛЬ ПРЕДМЕТЫ, ПРЕДОСТАВЛЯЕМЫЕ НАСТОЯЩИМ ЗАКАЗОМ НА ПОКУПКУ, ДОЛЖНЫ БЫТЬ ДОСТАВЛЕНЫ В ОФИЦЕР МАГАЗИНА, ЦЕНТРАЛЬНЫЙ МАГАЗИН, БАРК, ТРОМБЕЙ, МУМБАЙ — 400 085. НЕБОЛЬШИЕ УПАКОВКИ БУДУТ ПРИНЯТЫ. СЕВЕРНЫЕ ВОРОТА, БАРК, ТРОМБЕЙ МЕЖДУ 11:00 ДО 1245 ЧАСОВ И СНОВА С 14:00 ДО 17:00 ВСЕ РАБОЧИЕ ДНИ, КОГДА Тяжелые и громоздкие материалы должны быть доставлены в ЦЕНТРАЛЬНЫЙ БЛОК МАГАЗИНОВ ВНУТРИ БАРКА, ТРОМБЕЯ.ЧТОБЫ ОПРЕДЕЛИТЬ, КАКИЕ МАТЕРИАЛЫ ДОЛЖНЫ БЫТЬ ДОСТАВЛЕНЫ В ЦЕНТРАЛЬНЫЙ БЛОК МАГАЗИНОВ ВНУТРИ BARC, ЛИЦО / ТРАНСПОРТНЫЙ ПОДРЯДЧИК, КОТОРЫЙ БУДЕТ ДОСТАВЛЯТЬ МАТЕРИАЛ, ДОЛЖЕН ОБЯЗАТЕЛЬНО ПОЗВОНИТЬ / СООБЩИТЬ ХРАНИТЕЛЬСТВУ МАГАЗИНА, ДОБАВИТЬ, ДОБАВИТЬ, ПОЛУЧИТЬ ТРЕБОВАНИЕ ДЛЯ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО РЕШЕНИЯ

    7. УСЛОВИЯ ОПЛАТЫ 100% ОПЛАТА ВМЕСТЕ С ОБЯЗАТЕЛЬНЫМИ СБОРами, ПРИНЯТАЯ В НАСТОЯЩЕМ ЗАКАЗЕ НА ПОКУПКУ, ДОЛЖНА БЫТЬ СОВЕРШЕНА ПЛАТЕЖНЫМ ОРГАНОМ ПОКУПАТЕЛЯ И ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ В ТЕЧЕНИЕ 30 ДНЕЙ ПОЛУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛА И ПРИНЯТИЕ БАНКОВСКОЙ ГАРАНТИИ НА 10% ОТ СТОИМОСТИ ЗАКАЗА НА ВЫПОЛНЕНИЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ДЛЯ УДОВЛЕТВОРЕННОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ОБОРУДОВАНИЯ В ТЕЧЕНИЕ ГАРАНТИЙНОГО СРОКА

    8.ПЛАТЕЖНЫЙ ОРГАН СЧЕТА В ТРЕХ СЧЕТАХ ДОЛЖНЫ БЫТЬ ПРЕДОСТАВЛЕНЫ ОФИЦЕРУ ПО ПЛАТЕЖАМ И СЧЕТАМ, ДИРЕКЦИЯ ПО ПОКУПКАМ И МАГАЗИНАМ, ДЕПАРТАМЕНТ АТОМНОЙ ЭНЕРГИИ, 1-Й ЭТАЖ, ВИКРАМ САРАБХАЙ БХАВАН, АНУШАРА, 400, АНУШАК, 400. ПОДРЯДЧИК ОТПРАВЛЯЕТ ДОПОЛНИТЕЛЬНУЮ ПЕЧАТКУ НА КАЖДУЮ ПРЕТЕНЗИЮ ОБ ОПЛАТЕ ВМЕСТЕ СО СЧЕТАМИ В ТРОПОМ СЧЕТЕ, И ОПЛАТА СЧЕТА БУДЕТ ОТПРАВЛЕНА ЗАРЕГИСТРИРОВАННЫМ ПОЧТОМ.

    9. ОБЕСПЕЧЕНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ ПОДРЯДЧИК ПРЕДОСТАВЛЯЕТ ОБЯЗАТЕЛЬСТВО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ОБЯЗАТЕЛЬСТВ В ФОРМЕ БАНКОВСКОЙ ГАРАНТИИ СТРОГО, КАК СООТВЕТСТВУЕТ ФОРМАТ, ПРИЛОЖЕННЫЙ ПРИЛОЖЕНИЕМ ПРИ ПОКУПКЕ, НА 10% ОТ ОБЩЕЙ СТОИМОСТИ ДОГОВОРА.BG ВЫПУСКАЕТСЯ ГОСУДАРСТВЕННЫМ БАНКОМ ИНДИИ ИЛИ ЛЮБЫМ ИЗ НАЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ БАНКОВ ИЛИ УСТАВНЫМИ ЧАСТНЫМИ БАНКАМИ ICICI ИЛИ HDFC, ИЛИ ОСЬ, ИЛИ IDBI, ИСПОЛНЯЕТСЯ НА НЕЮДЕБСКОЙ БУМАГЕ С ПОДХОДЯЩЕЙ СТОИМОСТЬЮ И ДЕЙСТВИТЕЛЬНО ДЛЯ ВЕСЬ ГАРАНТИЙНЫЙ СРОК. ОБЩАЯ СТОИМОСТЬ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ БАНКОВСКОЙ ГАРАНТИИ составляет RS. 65,531 / —

    10. БАНКОВСКАЯ ГАРАНТИЯ БАНКОВСКАЯ ГАРАНТИЯ ДОЛЖНА БЫТЬ СТРОГО В СООТВЕТСТВИИ С ПРИЛОЖЕННЫМ ФОРМАТОМ, БЕЗ КАКИХ-ЛИБО ДОПОЛНЕНИЙ ИЛИ УДАЛЕНИЯ, И ТО ЖЕ ДОЛЖНО БЫТЬ ПОЛУЧИТЬСЯ В ОДНОМ БАНКЕ, ПРЕДСТАВЛЕННОМ В ГОСУДАРСТВЕННОМ БАНКЕ ИНДИИ. ЧАСТНЫЕ БАНКИ ICICI ИЛИ HDFC ИЛИ AXIS ИЛИ IDBI, ИСПОЛНЯЮТСЯ НА НЕСУДЕБНОЙ БУМАГЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕЙ ЦЕННОСТИ.БАНКОВСКАЯ ГАРАНТИЯ ДОЛЖНА БЫТЬ ПРЕДОСТАВЛЕНА НА ПОМОЩНИК ОФИЦЕРА ПО ЗАКУПКАМ ЦЕНТРАЛЬНАЯ ЗАКУПКА ДИРЕКЦИЯ ПО ПОКУПКАМ И МАГАЗИНАМ ОТДЕЛЕНИЕ АТОМНОЙ ЭНЕРГИИ ВИКРАМ САРАБХАЙ БХАВАН АНУШКТИ НАГАР ВАМ 400 094. БАНКОВСКИЕ ДАННЫЕ НАИМЕНОВАНИЕ БАНКА: ГОСУДАРСТВЕННЫЙ БАНК ИНДИИ, НАИМЕНОВАНИЕ ФИЛИАЛА: ФИЛИАЛ BARC АДРЕС: ЦЕНТРАЛЬНОЕ АДМИНИСТРАЦИЯ, ТРОМБЕЙ, МАМБАЙ 400085, КОД IFSC: SBIN0001268 ОРИГИНАЛЬНАЯ БАНКОВСКАЯ ГАРАНТИЯ ДОЛЖНА быть отправлена ​​БАНКОМ ПОКУПАТЕЛЮ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПОД ЗАРЕГИСТРИРОВАННЫМ ПОЧТОМ (AD).ОДНАКО, В ИСКЛЮЧИТЕЛЬНЫХ СЛУЧАЯХ, КОГДА ОРИГИНАЛЬНАЯ БАНКОВСКАЯ ГАРАНТИЯ ОТПРАВЛЯЕТСЯ / ВРУЧИВАЕТСЯ ПОКУПАТЕЛЮ НАПРЯМУЮ ПОДРЯДЧИКОМ, БАНК-ЭМИТНИК ДОЛЖЕН СОВЕТОВАТЬСЯ, ЧТО ОНИ СЛЕДУЕТ ОТПРАВИТЬ ДУБЛИКЦИОННУЮ КОПИЮ БАНКОВСКОЙ ГАРАНТИИ С ПОМОЩЬЮ НЕОБХОДИМОСТИ ПИСЬМО С ЗАПРОСАМИ СРАВНЕНИЯ С ОРИГИНАЛОМ, ПОЛУЧЕННЫМ ОТ ПОДРЯДЧИКА НАПРЯМУЮ, И ДВОЙНОЙ КОПИЕЙ, ОТПРАВЛЕННОЙ НАПРЯМУЮ БАНКОМ, НАДО ЗАКАЗАТЬ.

    No related posts.

    Похожие записи

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *