1 18 2: Решите пожалуйста)1)18:2 1/4 2)10:1 7/8 3)35:2 — Школьные Знания.com

Привет, добро пожаловать в Parts Town!

Parts Town и 3Wire объединились и объединились с IPC, объединив команду, которую вы знаете, с крупнейшим в отрасли товарным запасом и передовыми технологиями, чтобы предоставить вам абсолютно лучший опыт.Все выглядит немного по-другому, это правда, но вы действительно находитесь в нужном месте.

Привет, добро пожаловать в Parts Town!

Parts Town и 3Wire объединились и объединились с NDCP, объединив команду, которую вы знаете, с крупнейшим в отрасли товарным запасом и передовыми технологиями, чтобы предоставить вам абсолютно лучший опыт. Все выглядит немного по-другому, это правда, но вы действительно находитесь в нужном месте.

Привет, добро пожаловать в Parts Town!

Parts Town и 3Wire объединили усилия и объединились с SMS, объединив команду, которую вы знаете, с крупнейшим в отрасли товарным запасом и передовыми технологиями, чтобы предоставить вам абсолютно лучший опыт.Все выглядит немного по-другому, это правда, но вы действительно находитесь в нужном месте.

Привет!

RSCS и Parts Town объединили свои усилия, объединив знакомую команду с крупнейшим в отрасли товарным запасом и передовыми технологиями, чтобы предоставить вам лучший опыт. Все выглядит немного по-другому, это правда, но вы действительно находитесь в нужном месте.

Привет, добро пожаловать в Parts Town!

Parts Town и 3Wire Foodservice объединили свои усилия. Теперь вы будете работать с замечательной командой, которую знаете, имея при этом доступ к крупнейшему в отрасли инвентарю и передовым технологиям.Все выглядит немного по-другому, это правда, но вы действительно находитесь в нужном месте.

Что вы можете ожидать:

• Больше всего запчастей на планете — все OEM, все время
• Отличная технология, которая упрощает поиск и покупку запчастей, включая поиск серийного номера, PartSPIN® и интеллектуальные руководства, можно найти на сайте partstown.com и в нашем ведущем в отрасли мобильном приложении
• Исключительный опыт работы с клиентами от команды, которой вы доверяете, с каждым электронным письмом, живым чатом, текстовыми сообщениями и телефонными звонками, обеспечивается дружелюбной и знающей командой
• Позднее, чем кто-либо еще — поддержка и доставка всех заказов на складе до 9 вечера по восточному времени

Чего можно ожидать:

Готовы начать? Пошли!

Ищете запчасти для оборудования для напитков?

Marmon Link — это новый источник оригинальных запчастей для производителей оборудования Marmon.Найдите детали и аксессуары для розлива напитков, а также детали для Корнелиуса, Замка принца, Серебряного короля, Анджело По и Короля сабли.

• Отправьте!

  Отправка сегодня из Parts Town Корабли из Города Запчастей

  Отправлено из

  На складе, обычно отправляется 1-2 дня

  262,73 $ Моя цена: 262,73 $

  больше вариантов покупки для доставки

• Кол-во в наличии:

  Часы приема: Пн — пт

  Моя цена:

Авторизуйтесь, чтобы активировать Быстрый заказ

Ваша кредитная карта не может быть сохранена в настоящее время.Свяжитесь с нами или повторите попытку позже.

Что-то не так с вами введено. Пожалуйста, проверьте и введите снова

Обязательные поля.

Подтвердите подтвержденный адрес, который мы нашли для вас

Используйте проверенный адрес вместо

Введенный вами адрес

Нам не удалось найти этот точный адрес. Прежде чем продолжить, подтвердите, что указан правильный номер дома.

{{= productEntry.product.name}}

Больше не доступно: {{= productEntry.количество}}

{{если productEntry.availableQty> 0}} В наличии: {{= productEntry.availableQty}} {{/если}}

{{если productEntry.availableQty> = 0}} Невыполненный заказ: {{= productEntry.quantity — productEntry.availableQty}} {{еще}} Невыполненный заказ: {{= productEntry.quantity}} {{/если}}

В наличии: {{= productEntry.количество}}

КОЛ-ВО: {{= productEntry.количество}}

Платежная информация

{{= billingInfo.firstName}} {{= billingInfo.lastName}}
{{= billingInfo.line1}}
{{if billingInfo.line2! = »}} {{= billingInfo.line2}}
{{/ if}} {{= billingInfo.town}} {{if billingInfo.region}} {{= billingInfo.region.name}} {{/ if}}
{{= billingInfo.country.name}} {{= billingInfo.postalCode}}

Информация о доставке

{{= shippingInfo.firstName}} {{= shippingInfo.lastName}}
{{= shippingInfo.companyName}}
{{= shippingInfo.line1}}
{{if shippingInfo.line2! = »}} {{= shippingInfo.line2}}
{{/ if}} {{= shippingInfo.town}} {{if shippingInfo.region}} {{= shippingInfo.region.name}} {{/ if}}
{{= shippingInfo.country.name}} {{= shippingInfo.postalCode} }
{{= shippingInfo.Телефон}}

Информация о платеже

{{if paymentType.code == ‘CARD’}} {{= cart.paymentType.displayName}}
{{= paymentInfo.cardTypeData.name}}
{{= paymentInfo.formattedCardNumber}}
Exp. {{= paymentInfo.expiryMonth}} {{= paymentInfo.expiryYear}} {{еще}} Выставить счет на мой счет {{/если}}

Способ доставки

{{if deliveryMode.code == ‘фрахт-отгрузка’}} {{= deliveryMode.название}} {{/если}} {{html deliveryMode.description}}
{{= deliveryMode.deliveryCost.formattedValue}}

Введите дополнительную информацию

Номер заказа (необязательно)

SUBTOTAL {{= cart.subTotal.formattedValue}}

Доставка и обработка: {{= cart.deliveryCost.formattedValue}}

Налоги: {{= cart.totalTax.formattedValue}}

Скидки: — {{= cart.orderDiscounts.formattedValue}}

Пошлины и сборы: включены

Total {{= cart.totalPriceWithTax.formattedValue}}

МОЯ ЭКОНОМИЯ {{= cart.totalPrice.formattedSaving}}

ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ: ваша страна может взимать импортные пошлины, налоги и сборы, которые вам, возможно, придется заплатить до доставки.

Производитель #:

4810-100-12-18

Часть города запчастей:

JAC4810-100-12-18

Жители Калифорнии:

Предложение 65 Предупреждение

Имеет право на плановое пополнение.

Jackson 4810-100-12-18 Подлинная запасная часть OEM

КЛАПАН, СОЛЕНОИДНЫЙ 1/2 115/60

Меню 26.02.18 — 28.02.18 | Край воды

Меню блюд в морозильной камере

ПОЖАЛУЙСТА, РАЗМЕСТИТЕ ЗАКАЗ ДО ПОЛДЕНЬ В СРЕДУ 28.02.2018

Пожалуйста, используйте западную дверцу при приеме заказов.

Заказы Можно забрать с 11:00 до 18:00 3.08.2018. Или назначив встречу.

Входы

Ракушки для макарон с начинкой из тако
Маленькие — 5,75 долларов США (2 порции) Средние — 11,75 долларов США (4-6 порций) Большие — 19,25 долларов США (8-10 порций) соус.

Цыпленок с кешью в горшочке
Маленький — 5,75 долларов (2 порции) Средний — 11,75 долларов (4-6 порций) Большой — 19 долларов.25 (на 8-10 порций) Готово к работе с мультиваркой.

Кисло-сладкие свиные отбивные
Маленькие — 5,75 долларов США (2 порции) Средние — 11,75 долларов США (4-6 порций) Большие — 19,25 доллара США (8-10 порций)
Свиные отбивные с идеальным сочетанием кисло-сладкого.

На светлой стороне

Жареный цыпленок с медом

Small — 5,75 долларов США (на 2 порции) Medium — 11 долларов США.75 (на 4-6 порций) Большой — 19,25 $ (на 8-10 порций) Куриные грудки со сладким медовым соусом терияки

Суп

Суп с курицей и диким рисом Маленький — (2 порции) 5,75 $ Средний — 11,75 $ (4-6 порций) Большой — 19 $.25 (на 8-10 порций)
Курица, бекон и дикий рис в восхитительном сливочном супе!

Скобы — в наличии у нас

Ham Balls Малый — 5,75 доллара (2 порции) Средний — 11,75 доллара (4-6 порций) Большой — 19,25 доллара (8-10 порций)

Запеканка для спагетти и фрикаделек
Small — 5 долларов.75 (2 порции) Средний — 11,75 $ (4-6 порций) Большой — 19,25 $ (8-10 порций)

Сырный картофель
Маленький — 4,75 доллара (2 порции) Средний — 8,00 долларов (4-6 порций) Большой — 11,25 доллара (8-10 порций)

Cavatini
Малый — 7,75 доллара (2 порции) Средний — 13,75 доллара (4-6 порций) Большой — 21,25 доллара (8-10 порций)

Картофельное пюре
Маленькое — 4,50 доллара (2 порции) Среднее — 7,75 доллара (4-6 порций) Большое — 11,25 доллара (8-10 порций)

Картофельное пюре, запеченное дважды
Small — 4 доллара.75 (2 порции) Средний — 8,00 $ (4-6 порций) Большой — 11,25 $ (8-10 порций)

3 Cheese Mac & Cheese
Маленький 5,75 долл. США (2 порции) Средний — 11,75 (4-6 порций) Большой — 19,25 долл. США (8-10 порций)

Картофельное пюре с жареным чесноком
Маленькое — 4,25 доллара (2 порции) Среднее — 7,75 доллара (4-6 порций) Большое — 11,00 долларов (8-10 порций)

Замороженное тесто для печенья с шоколадной крошкой
6.50 $ / дюжина $ 13.00 / 2 дюжины

Сделайте заказ сейчас!

Калькулятор факторинга

Использование калькулятора

Калькулятор факторинга находит факторы и пары факторов положительного или отрицательного числа.Введите целое число, чтобы найти его множители.

Для положительных целых чисел калькулятор будет отображать только положительные множители, потому что это обычно принятый ответ. Например, вы получаете 2 и 3 как пару факторов из 6. Если вам также нужны отрицательные факторы, вам нужно будет продублировать ответ самостоятельно и повторить все факторы как отрицательные, такие как -2 и -3, как еще одну пару факторов из 6. С другой стороны, этот калькулятор даст вам отрицательные множители для отрицательных целых чисел.Например, -2 и 3 И 2 и -3 являются парами факторов -6.

Факторы — это целые числа, которые умножаются для получения другого числа. Исходные числа являются множителями номера продукта. Если a x b = c, то a и b являются делителями c.

Допустим, вы хотите найти множители 16. Вы найдете все пары чисел, которые при умножении дают 16. Мы знаем, что 2 и 8 являются множителями 16, потому что 2 x 8 = 16. 4 — это множитель 16, потому что 4 х 4 = 16.Также 1 и 16 делятся на 16, потому что 1 x 16 = 16. Факторы 16 равны 1, 2, 4, 8, 16.

Вы также можете думать о множителях в терминах деления: множители числа включают в себя все числа, которые делятся на это число без остатка. Рассмотрим число 10. Поскольку 10 делится на 2 и 5 без остатка, можно сделать вывод, что 2 и 5 делятся на 10.

В таблице ниже перечислены множители для 3, 18, 36 и 48. Важно отметить, что каждое целое число имеет как минимум два множителя: 1 и само число.Если число состоит только из двух факторов, это число является простым числом.

Примеры списков факторов

36

1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 18, 36

48

1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 24, 48

Как разложить числа на множители: факторизация

Калькулятор множителей учитывает числа пробным делением.Выполните следующие действия, чтобы использовать пробное деление для определения множителей числа.

1. Найдите квадратный корень целого числа n и округлите до ближайшего целого числа. Назовем этот номер s .
2. Начните с числа 1 и найдите соответствующую пару факторов: n ÷ 1 = н. . Итак, 1 и n — это факторная пара, потому что деление дает целое число с нулевым остатком.
3. Сделайте то же самое с числом 2 и продолжите проверку всех целых чисел ( n ÷ 2, n ÷ 3, n ÷ 4 … n ÷ s ) до квадратного корня с округлением до с . Запишите пары факторов, в которых деление дает целые числа с нулевым остатком.
4. Когда вы наберете n ÷ s и вы записали все пары факторов, вы успешно разложили на множители число н. .

Пример факторизации с использованием пробного отдела

Факторы 18:

• Квадратный корень из 18 равен 4,2426, с округлением до ближайшего целого числа 4
• Проверяя целочисленные значения от 1 до 4 для деления на 18 с остатком 0, мы получаем следующие пары факторов: (1 и 18), (2 и 9), (3 и 6). Множители 18: 1, 2, 3, 6, 9, 18.

Факторы отрицательных чисел

Вся приведенная выше информация и методы обычно применимы для разложения отрицательных чисел на множители.Просто обязательно следуйте правилам умножения и деления отрицательных чисел, чтобы найти все множители отрицательных чисел. Например, множители -6: (1, -6), (-1, 6), (2, -3), (-2, 3). См. Калькулятор решения математических уравнений и раздел Правила операций умножения.

Дополнительная литература

Отрицательные множители других чисел? на http://mathforum.org/library/drmath/view/63516.html

Калькуляторы сопутствующего факторинга

Смотрите наши Калькулятор общих факторов, чтобы найти все факторы набора чисел и узнать, какие факторы являются общими.

г. Калькулятор наибольшего общего множителя находит наибольший общий делитель (НОД) или наибольший общий делитель (НОД) набора чисел.

Посмотреть Калькулятор наименьшего общего знаменателя, чтобы найти наименьший общий знаменатель для дробей, целых и смешанных чисел.

§ 18.2–248. Производство, продажа, передача, распространение или хранение с намерением произвести, продать, передать или распространить запрещенное вещество или имитация контролируемого вещества; штрафы

A.За исключением случаев, предусмотренных в Законе о контроле над наркотиками (§ 54.1-3400 и последующие), производство, продажа, передача, распространение или владение каким-либо лицом с целью производства, продажи, передачи или распространения контролируемого вещества или имитация контролируемого вещества.

B. При определении того, намеревается ли какое-либо лицо производить, продавать, передавать или распространять имитацию контролируемого вещества, суд может рассмотреть, помимо всех других соответствующих доказательств, было ли какое-либо распространение или попытка распространения таких пилюль, капсул, таблеток или вещества в любой другой форме, включая обмен или требование денег или другого имущества в качестве возмещения, и, если да, то была ли сумма такого возмещения существенно больше разумной стоимости такой пилюли, капсулы, таблетки или вещества в любом в любой другой форме, с учетом фактического химического состава таких пилюль, капсул, таблеток или вещества в любой другой форме и, где это применимо, цены, по которой продаются безрецептурные вещества аналогичного химического состава.

C. За исключением случаев, предусмотренных в подразделе C1, любое лицо, нарушившее этот раздел в отношении контролируемого вещества, включенного в Список I или II, после осуждения будет приговорено к тюремному заключению на срок от пяти до 40 лет и штрафу на сумму не более 500 000 долларов. . После второго осуждения за такое нарушение, и в ордере, обвинительном заключении или информации утверждается, что лицо ранее было осуждено за такое преступление или по существу аналогичное преступление в любой другой юрисдикции, такое преступление будет считаться уголовным преступлением, если совершено в Содружестве, и такое предыдущее осуждение произошло до даты совершения преступления, указанного в ордере, обвинительном заключении или информации, любое такое лицо может, по усмотрению суда или присяжных, выносящих приговор, быть приговоренным к лишению свободы на всю жизнь или на любой период не менее пяти лет, три года из которых должны быть обязательным минимальным сроком тюремного заключения, который должен отбываться последовательно с любым другим приговором, и он должен быть оштрафован на сумму не более 500 000 долларов.

Когда лицо осуждено за третье или последующее правонарушение в соответствии с настоящим подразделом и в ордере, обвинительном заключении или информации утверждается, что оно было ранее осуждено за два или более таких правонарушения или по существу аналогичных правонарушений в любой другой юрисдикции, в которой правонарушения считалось бы уголовным преступлением, если бы оно было совершено в Содружестве, и такие предыдущие судимости имели место до даты совершения преступления, указанного в ордере, обвинительном заключении или информации, он должен быть приговорен к лишению свободы на всю жизнь или на срок не менее 10 лет, 10 лет из которых должен быть обязательный минимальный срок тюремного заключения, который должен отбываться последовательно с любым другим приговором, и он должен быть оштрафован на сумму не более 500 000 долларов.

Любое лицо, которое производит, продает, дает, распространяет или владеет с намерением производить, продавать, передавать или распространять следующее, виновно в совершении тяжкого преступления, наказуемого штрафом в размере не более 1 миллиона долларов и лишением свободы на срок от пяти лет до пожизненного заключения. , пять лет из которых должны быть обязательным минимальным сроком тюремного заключения, который должен быть отбыт последовательно с любым другим приговором:

1. 100 граммов или более смеси или вещества, содержащего поддающееся обнаружению количество героина;

2.500 граммов или более смеси или вещества, содержащего детектируемое количество:

a. Листья коки, за исключением листьев коки и экстрактов листьев коки, из которых удалены кокаин, экгонин и производные экгонина или их соли;

г. Кокаин, его соли, оптические и геометрические изомеры и соли изомеров;

г. Экгонин, его производные, их соли, изомеры и соли изомеров; или

г. Любое соединение, смесь или препарат, который содержит любое количество любого из веществ, указанных в подразделах 2a — 2c;

3.250 граммов или более смеси или вещества, описанного в подразделах 2a — 2d, которые содержат основание кокаина; или

4. 10 граммов или более метамфетамина, его солей, изомеров или солей его изомеров или 20 граммов или более смеси или вещества, содержащего определяемое количество метамфетамина, его солей, изомеров или солей его изомеров.

Обязательный минимальный срок тюремного заключения, назначаемый за нарушение данного пункта, не применяется, если суд установит, что:

a.Лицо не имело ранее судимости за правонарушение, указанное в подразделе C § 17.1-805;

г. Лицо не прибегало к насилию или реальным угрозам насилия, не обладало огнестрельным или другим опасным оружием в связи с преступлением и не склоняло к этому другого участника преступления;

г. Преступление не привело к смерти или серьезным телесным повреждениям никому;

г. Это лицо не являлось организатором, лидером, менеджером или руководителем других лиц, участвовавших в преступлении, и не участвовало в продолжающемся преступном предприятии, как это определено в подразделе I; и

e.Не позднее времени слушания приговора лицо правдиво предоставило Содружеству всю информацию и доказательства, которые оно имеет в отношении правонарушения или правонарушений, которые были частью того же образа поведения или общей схемы или плана, но факт то, что лицо не имеет соответствующей или полезной другой информации, которую можно было бы предоставить, или что Содружеству уже известно об этой информации, не препятствует определению судом того, что ответчик выполнил это требование.

C1. Любое лицо, нарушающее этот раздел в отношении производства метамфетамина, его солей, изомеров или солей его изомеров или менее 200 граммов смеси или вещества, содержащего определяемое количество метамфетамина, его солей, изомеров или солей его изомеры должны быть приговорены к тюремному заключению на срок от 10 до 40 лет и к штрафу в размере не более 500 000 долларов. При повторном осуждении за такое нарушение любое такое лицо может, по усмотрению суда или присяжных, выносящих приговор, быть приговоренным к лишению свободы на всю жизнь или на любой срок не менее 10 лет и оштрафовано на сумму не более 500 000 долларов.Когда лицо признано виновным в третьем или последующем правонарушении в соответствии с настоящим подразделом и в ордере, обвинительном заключении или информации утверждается, что оно ранее было осуждено за два или более таких правонарушения или по существу аналогичных правонарушений в любой другой юрисдикции, причем эти правонарушения считалось бы уголовным преступлением, если бы оно было совершено в Содружестве, и такие предыдущие судимости имели место до даты совершения преступления, указанного в ордере, обвинительном заключении или информации, он должен быть приговорен к лишению свободы на всю жизнь или на срок не менее 10 лет, три года который является обязательным минимальным сроком тюремного заключения, который должен отбываться последовательно с любым другим приговором, и он должен быть оштрафован на сумму не более 500 000 долларов.

После осуждения, в дополнение к любому другому наказанию, лицо, признанное виновным в этом правонарушении, должно быть приказано судом произвести реституцию, если суд сочтет это целесообразным, любому невиновному владельцу собственности, чье имущество повреждено, уничтожено или иным образом передано. непригодный для использования в результате такого производства метамфетамина. Эта реституция должна включать предполагаемые или фактические расходы лица или его имущества, связанные с уборкой, удалением или ремонтом пострадавшего имущества. Если имущество, которое повреждено, уничтожено или иным образом приведено в негодность в результате такого производства метамфетамина, является имуществом, полностью или частично принадлежащим осужденному, суд обязал это лицо выплатить в Фонд очистки от метамфетамина, уполномоченный в § 18. .2-248.04 разумные предполагаемые или фактические расходы, связанные с очисткой, удалением или ремонтом пострадавшего имущества, или, если фактические или предполагаемые расходы не могут быть определены, сумма в размере 10 000 долларов США. Осужденный также должен оплатить стоимость удостоверения того, что любое здание, которое очищается или ремонтируется в соответствии с этим разделом, безопасно для проживания людей в соответствии с руководящими принципами, установленными в соответствии с § 32.1-11.7.

D. Если такое лицо докажет, что оно передавало, распространяло или обладало с намерением передать или распространять контролируемое вещество, включенное в Список I или II, только в качестве помещения для другого человека, который не является заключенным в исправительном учреждении сообщества, местное исправительное учреждение учреждение или государственное исправительное учреждение, как определено в § 53.1-1 или под опекой своего сотрудника, и не с намерением извлечь из этого выгоду из полученного или ожидаемого вознаграждения или побудить получателя или предполагаемого получателя контролируемого вещества использовать или стать зависимым от такого контролируемого вещества, он должен быть виновен в тяжком преступлении класса 5.

E. Если нарушение положений данной статьи заключается в заполнении фармацевтом рецепта лица, уполномоченного в соответствии с этой статьей выдавать его, причем рецепт не был получен фармацевтом в письменной форме до заполнения и такой письменный рецепт фактически получен фармацевтом в течение одной недели с момента его заполнения, или если такое нарушение состоит в запросе такого уполномоченного лица о заполнении фармацевтом рецепта, который не был получен в письменной форме фармацевтом, и такой рецепт фактически выписывается во время такого запроса и доставляется фармацевту в течение одной недели; любое такое правонарушение считается правонарушением класса 4.

E1. Любое лицо, которое нарушает этот раздел в отношении контролируемого вещества, включенного в Список III, за исключением анаболического стероида, включенного в Список III, что представляет собой нарушение пунктов 18.2-248.5, должно быть виновно в совершении преступления класса 5.

E2. Любое лицо, нарушившее этот раздел в отношении контролируемого вещества, включенного в Список IV, должно быть виновно в уголовном преступлении 6 класса.

E3. Любое лицо, которое докажет, что он давал, распространял или обладал с намерением передавать или распространять контролируемое вещество, включенное в Список III или IV, за исключением анаболического стероида, включенного в Список III, что является нарушением § 18.2-248.5, только в качестве жилья для другого человека, который не является заключенным в исправительном учреждении сообщества, местном исправительном учреждении или государственном исправительном учреждении, как определено в § 53.1-1, или под стражей их сотрудника, а не с намерением извлекать выгоду из полученного или ожидаемого вознаграждения, а также не побуждать получателя или предполагаемого получателя контролируемого вещества использовать или становиться зависимым от такого контролируемого вещества, является виновным в правонарушении класса 1.

F. Любое лицо, нарушившее этот раздел в отношении контролируемого вещества, включенного в Список V или Список VI, или имитацию контролируемого вещества, которое имитирует контролируемое вещество, включенное в Список V или Список VI, должно быть виновно в правонарушении класса 1.

G. Любое лицо, которое нарушает этот раздел в отношении имитации контролируемого вещества, которое имитирует контролируемое вещество, классифицированное в Списках I, II, III или IV, должно быть виновно в уголовном преступлении класса 6.В любом судебном преследовании, возбужденном в соответствии с этим подразделом, не является оправданием нарушения этого подраздела тот факт, что ответчик считал имитацию контролируемого вещества фактически контролируемым веществом.

H. Любое лицо, которое производит, продает, передает, распространяет или владеет с намерением производить, продавать, передавать или распространять следующее:

1. 1,0 килограмм или более смеси или вещества, содержащего поддающееся обнаружению количество героина;

2. 5,0 кг или более смеси или вещества, содержащего определяемое количество:

a.Листья коки, за исключением листьев коки и экстрактов листьев коки, из которых удалены кокаин, экгонин и производные экгонина или их соли;

г. Кокаин, его соли, оптические и геометрические изомеры и соли изомеров;

г. Экгонин, его производные, их соли, изомеры и соли изомеров; или

г. Любое соединение, смесь или препарат, который содержит любое количество любого из веществ, указанных в подразделах от а до с;

3. 2,5 кг или более смеси или вещества, описанного в подразделе 2, которое содержит кокаиновое основание;

4.100 кг или более смеси или вещества, содержащего определяемое количество марихуаны; или

5. 100 граммов или более метамфетамина, его солей, изомеров или солей его изомеров или 200 граммов или более смеси или вещества, содержащего определяемое количество метамфетамина, его солей, изомеров или солей его изомеров, должны быть виновным в совершении тяжкого преступления, наказуемого штрафом в размере не более 1 миллиона долларов и лишением свободы на срок от 20 лет до пожизненного заключения, из которых 20 лет должны быть минимальным обязательным наказанием.Такое обязательное минимальное наказание не применяется, если суд установит, что (i) лицо не имеет ранее судимости за правонарушение, указанное в подразделе C § 17.1-805; (ii) лицо не прибегало к насилию или реальным угрозам насилия, не владело огнестрельным или другим опасным оружием в связи с преступлением и не склоняло к этому другого участника преступления; (iii) правонарушение не привело к смерти или серьезным телесным повреждениям любого человека; (iv) данное лицо не являлось организатором, лидером, менеджером или руководителем других лиц в преступлении и не участвовало в продолжающейся преступной деятельности, как это определено в подразделе I этого раздела; и (v) не позднее времени слушания приговора лицо правдиво предоставило Содружеству всю информацию и доказательства, которые оно имеет в отношении правонарушения или правонарушений, которые были частью того же образа поведения или общей схемы или плана. , но тот факт, что лицо не имеет соответствующей или полезной другой информации, которую можно было бы предоставить, или что Содружеству уже известно об этой информации, не препятствует определению судом того, что ответчик выполнил это требование.

h2. Любое лицо, которое было руководителем или одним из нескольких главных администраторов, организаторов или руководителей продолжающегося преступного предприятия, должно быть виновно в совершении уголовного преступления, если (i) предприятие получило не менее 100 000 долларов, но менее 250 000 долларов валовой выручки в течение любого 12-месячного периода. о его существовании в результате производства, импорта или распространения героина или кокаина, экгонина или метамфетамина или их производных, солей, изомеров или солей изомеров или марихуаны, или , распространять или владеть с намерением производить, продавать, передавать или распространять в течение любого 12-месячного периода своего существования:

1.Не менее 1,0 кг, но менее 5,0 кг смеси или вещества, содержащего поддающееся обнаружению количество героина;

2. Не менее 5,0 кг, но менее 10 кг смеси или вещества, содержащего определяемое количество:

a. Листья коки, за исключением листьев коки и экстрактов листьев коки, из которых удалены кокаин, экгонин и производные экгонина или их соли;

г. Кокаин, его соли, оптические и геометрические изомеры и соли изомеров;

г.Экгонин, его производные, их соли, изомеры и соли изомеров; или

г. Любое соединение, смесь или препарат, который содержит любое количество любого из веществ, указанных в подразделах от а до с;

3. Не менее 2,5 кг, но менее 5,0 кг смеси или вещества, описанного в подразделе 2, которое содержит кокаиновое основание;

4. Не менее 100 кг, но менее 250 кг смеси или вещества, содержащего определяемое количество марихуаны; или

5.Не менее 100 граммов, но менее 250 граммов метамфетамина, его солей, изомеров или солей его изомеров или не менее 200 граммов, но менее 1,0 килограмма смеси или вещества, содержащего определяемое количество метамфетамина, его солей, изомеров или соли его изомеров.

Осуждение по данному разделу наказывается штрафом в размере не более 1 миллиона долларов и лишением свободы на срок от 20 лет до пожизненного заключения, из которых 20 лет должны быть минимальным обязательным наказанием.

h3. Любое лицо, которое было главным или одним из нескольких главных администраторов, организаторов или руководителей продолжающегося преступного предприятия, если (i) предприятие получило валовую выручку в размере 250 000 долларов или более в течение любого 12-месячного периода своего существования от производства, импорта или распространение героина или кокаина, экгонина или метамфетамина или их производных, солей, изомеров или солей изомеров или марихуаны, или (ii) лицо, занимающееся на предприятии производством, продажей, передачей, распространением или владением с целью производства продавать, передавать или распространять следующее в течение 12 месяцев своего существования:

1.Не менее 5,0 кг смеси или вещества, содержащего поддающееся обнаружению количество героина;

2. Не менее 10 кг смеси или вещества, содержащего определяемое количество:

a. Листья коки, за исключением листьев коки и экстрактов листьев коки, из которых удалены кокаин, экгонин и производные экгонина или их соли;

г. Кокаин, его соли, оптические и геометрические изомеры и соли изомеров;

г. Экгонин, его производные, их соли, изомеры и соли изомеров; или

г.Любое соединение, смесь или препарат, который содержит любое количество любого из веществ, указанных в подразделах от а до с;

3. Не менее 5,0 кг смеси или вещества, описанного в подразделе 2, которое содержит кокаиновую основу;

4. Не менее 250 кг смеси или вещества, содержащего определяемое количество марихуаны; или

5. Не менее 250 граммов метамфетамина, его солей, изомеров или солей его изомеров или не менее 1,0 килограмма смеси или вещества, содержащего определяемое количество метамфетамина, его солей, изомеров или солей его изомеров, должно быть виновным в совершении тяжкого преступления, наказуемого штрафом в размере не более 1 миллиона долларов и пожизненным тюремным заключением, которое должно быть отбыто без приостановления, полностью или частично.Такое наказание должно выполняться последовательно с любым другим приговором. Однако суд может назначить обязательное минимальное наказание в виде 40 лет, если суд установит, что ответчик существенно сотрудничал с правоохранительными органами.

I. Для целей этого раздела, лицо участвует в продолжающейся преступной деятельности, если (i) оно нарушает какое-либо положение этого раздела, наказание за которое является уголовным преступлением, и либо (ii) такое нарушение является частью продолжающаяся серия нарушений данного раздела, которые предпринимаются таким лицом совместно с пятью или более другими лицами, в отношении которых такое лицо занимает должность организатора, должность надзора или любую другую должность управления и от которых такое лицо получает существенный доход или ресурсы, или (iii) такое нарушение совершено в отношении метамфетамина или другого контролируемого вещества, включенного в Список I или II, в пользу, по указанию или в сотрудничестве с любой преступной уличной бандой, как определено в § 18.2-46.1.

J. За исключением случаев, предусмотренных Законом о контроле над наркотиками (§ 54.1-3400 и последующие), любое лицо, владеющее двумя или более различными веществами, перечисленными ниже, с целью производства метамфетамина, меткатинона или амфетамина, виновно в классе 6 тяжкое преступление: сжиженный газообразный аммиак, нитрат аммония, эфир, растворы гипофосфорной кислоты, соли гипофосфита, соляная кислота, кристаллы йода или настойка йода, фенилацетон, фенилуксусная кислота, красный фосфор, метиламин, метилформамид, литий, металлический натрий, серная кислота, гидроксид натрия, дихромат калия, дихромат натрия, перманганат калия, триоксид хрома, метилбензол, препараты-предшественники метамфетамина, трихлорэтан или 2-пропанон.

K. Термин «лекарственное средство-предшественник метамфетамина», когда он используется в этой статье, означает лекарственное средство или продукт, содержащий эфедрин, псевдоэфедрин или фенилпропаноламин или любые их соли, оптические изомеры или соли оптических изомеров.

Кодекс 1950, § 54-524.101: 1; 1972, г. 798; 1973, г. 479; 1974, г. 586; 1975, см. 14, 15; 1976, г. 614; 1977, г. 409; 1978, см. 177, 779; 1979, г. 435; 1982, см. 276, 462; 1985, г. 569; 1986, г. 453; 1988, г. 355; 1990, г. 82; 1991, г. 13; 1992, см.685, 737, 756; 1995, г. 538; 1999, г. 722; 2000, куб. 1020, 1041; 2004, г. 461; 2005, см. 174, 759, 796, 923, 941; 2006, см. 697, 759; 2008, см. 79, 618; 2009, г. 750; 2012, см. 219, 710, 844; 2013, г. 426; 2014, г. 513.

Развитие иммунитета к SARS-CoV-2

Отчетность

Никаких статистических методов не использовалось для предварительного определения размера выборки. Эксперименты не были рандомизированы, и исследователи не были закрыты для распределения во время экспериментов и оценки результатов.

Участники исследования

Ранее включенные в исследование участники ¹ попросили вернуться на 6-месячный контрольный визит в больницу Рокфеллерского университета с 31 августа по 16 октября 2020 года. Подходящими участниками были взрослые в возрасте от 18 до 76 лет и были либо диагностированы SARS-CoV-2 с помощью RT-PCR (случаи), либо были близкими контактами (например, членами одной семьи, коллегами или членами одной религиозной общины) с кем-то, кому был поставлен диагноз SARS-CoV- 2 инфицирование методом ОТ – ПЦР (контакты).Тесные контакты без сероконверсии против SARS-CoV-2 по оценке серологических анализов (описанных в «Высокопроизводительных автоматизированных серологических анализах») не были включены в последующий анализ. Большинство участников исследования были жителями трех штатов большого города Нью-Йорка, и их попросили вернуться примерно через шесть месяцев после появления симптомов COVID-19. Участники явились в больницу Рокфеллерского университета для сбора образцов крови, и им было предложено вспомнить симптомы и тяжесть клинических проявлений во время острой (первые шесть недель) и выздоравливающей (семь недель до второго визита исследования) фазы COVID-19, соответственно.Тяжесть острой инфекции оценивалась по «Обычной шкале клинического прогрессирования / улучшения» Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (https://www.who.int/publications/i/item/covid-19-therapy-trial-synopsis) . Одышку оценивали с помощью модифицированной шкалы одышки Совета медицинских исследований ⁴³ . Участники, у которых наблюдались стойкие симптомы, связанные с COVID-19, были идентифицированы на основании хронической одышки или усталости, дефицита спортивных способностей и / или трех или более дополнительных долгосрочных симптомов, таких как стойкая необъяснимая лихорадка, боль в груди, новые- начальные сердечные осложнения, артралгии, нарушение концентрации внимания или остроты ума, нарушение обоняния или вкуса, невропатия или кожные проявления ^3,4 .Все участники Рокфеллеровского университета предоставили письменное информированное согласие перед участием в исследовании, и исследование было проведено в соответствии с надлежащей клинической практикой. Сбор и обработка клинических данных проводились с использованием программного обеспечения iRIS от iMedRIS. Исследование было проведено с соблюдением всех соответствующих этических норм, а протокол исследований с участием людей был одобрен институциональным наблюдательным советом (IRB) Университета Рокфеллера.

Когорта биопсии желудочно-кишечного тракта

Чтобы определить, может ли SARS-CoV-2 сохраняться в желудочно-кишечном тракте, мы набрали когорту из 14 человек с предварительным диагнозом и выздоровлением от болезни COVID-19.Подходящие участники включали взрослых в возрасте 18–76 лет, которым ранее был поставлен диагноз SARS-CoV-2 с помощью ОТ-ПЦР или комбинации клинических симптомов, соответствующих COVID-19, плюс свидетельства сероконверсии, представленных в гастроэнтерологические клиники Mount Синайская больница. Эндоскопические процедуры были выполнены для клинически показанных состояний, как подробно описано в дополнительной таблице 7. У всех участников не было симптомов на момент эндоскопических процедур и отрицательных на SARS-CoV-2 по данным ПЦР с мазком из носа (порог цикла ( C _t ) отсечка <38).

Лаборатория системы здравоохранения Mount Sinai, сертифицированная CLIA, проверила разработанный лабораторией тест RT – PCR с мазком из носоглотки в реальном времени в соответствии с процедурой валидации SARS-CoV-2 в Центре Уодсворта Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк ⁴⁴ . Информированное согласие было получено от всех участников. Исследования, связанные с биопсией, были одобрены Комитетом по этике горы Синай / IRB (IRB 16-0583, «Влияние вирусных инфекций и их лечение на иммунные клетки желудочно-кишечного тракта»).

SARS-CoV-2 ПЦР-тест слюны

Метод ПЦР SARS-CoV-2 для образцов слюны был разработан Лабораторией клинической геномики Рокфеллерского университета, и его рабочие характеристики были определены. Этот лабораторный тест был разрешен штатом Нью-Йорк на основании разрешения на использование в чрезвычайных ситуациях для использования уполномоченными лабораториями. Слюну собирали в гуанидинтиоцианатный буфер, как описано ранее ⁴⁵ . РНК экстрагировали с использованием либо колоночного метода (Qiagen QIAmp DSP Viral RNA Mini Kit, 61904), либо метода на основе магнитных шариков, как описано ранее ⁴⁶ .КДНК с обратной транскрипцией была амплифицирована с использованием праймеров и зондов, утвержденных Центрами по контролю и профилактике заболеваний или Лабораторией персонализированной медицины Колумбийского университета, соответственно, и одобренных Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США в соответствии с разрешением на экстренное использование. Вирусная РНК считалась обнаруженной, если C _t для двух комбинаций вирусных праймеров и зондов было <40.

Обработка и хранение образцов крови

Мононуклеарные клетки периферической крови получали градиентным центрифугированием и хранили в жидком азоте в присутствии ФТС и ДМСО.Образцы гепаринизированной плазмы и сыворотки разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° C или ниже. Перед экспериментами аликвоты образцов плазмы инактивировали нагреванием (56 ° C в течение 1 ч), а затем хранили при 4 ° C.

Высокопроизводительные автоматизированные серологические анализы

Образцы плазмы от 80 из 87 участников были протестированы с помощью высокопроизводительных автоматизированных серологических анализов. Тест Roche Elecsys на анти-SARS-CoV-2 проводили на Roche Cobas e411 (Roche Diagnostics). В анализе Elecsys anti-SARS-CoV-2 для определения антител против SARS-CoV-2 используется рекомбинантный белок, представляющий антиген N.Этот анализ получил разрешение на экстренное использование от Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США ⁶ . Тесты Pylon COVID-19 IgG и IgM использовались для измерения антител IgG и IgM в плазме крови к SARS-CoV-2 соответственно. Образцы плазмы анализировали на анализаторе Pylon 3D (ET HealthCare), как описано ранее ⁵ . Этот тест был реализован клинически как лабораторный тест в соответствии с правилами Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк. Вкратце, анализ проводился с использованием унифицированной тест-полоски, содержащей лунки с предварительно нанесенными реагентами.Реагент COVID-19 содержит биотинилированные рекомбинантные версии RBD S-белка SARS-CoV-2 и следовые количества белка N в качестве антигенов, связывающих IgG и IgM, соответственно. Пороговые значения для обоих тестов Pylon были определены с использованием среднего значения для образцов, не относящихся к COVID-19, плюс 6 s.d. Результаты по образцу сообщаются в виде индекса отсечения или значения индекса, которые были определены путем деления показаний прибора для исследуемого образца на показания прибора при отсечении.

ELISA

ELISA ^47,48 для оценки связывания антител с SARS-CoV-2 N (Sino Biological 40588-V08B), RBD и дополнительных RBD проводили путем покрытия 96-полулуночных планшетов с высоким связыванием (Corning 3690) с 50 мкл на лунку 1 мкг раствора белка ^-1 в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение ночи при 4 ° C.Планшеты промывали 6 раз промывочным буфером (1 × PBS с 0,05% Tween-20 (Sigma-Aldrich)) и инкубировали со 170 мкл на лунку блокирующего буфера (1 × PBS с 2% BSA и 0,05% Tween-20 (Sigma). ) в течение 1 ч при комнатной температуре. Сразу после блокирования моноклональные антитела или образцы плазмы добавляли в PBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Образцы плазмы анализировали при начальном разведении 1:67 и 7 дополнительных трехкратных серийных разведениях. Моноклональные антитела тестировали при начальной концентрации 10 мкг / мл ^-1 и 10 дополнительных четырехкратных серийных разведениях.Планшеты промывали 6 раз промывочным буфером, а затем инкубировали с вторичными антителами против человеческого IgG, IgM или IgA, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson Immuno Research 109-036-088 109-035-129 и Sigma A0295) в блокирующем буфере. при разведении 1: 5000 (IgM и IgG) или при разведении 1: 3000 (IgA). Планшеты проявляли добавлением субстрата HRP, TMB (ThermoFisher) в течение 10 мин (образцы плазмы) или 4 мин (моноклональные антитела), затем реакцию развития останавливали добавлением 50 мкл 1 MH ₂ SO ₄ и оптической плотности. измеряли при 450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов ELISA (FluoStar Omega, BMG Labtech) с программным обеспечением Omega и Omega MARS для анализа.Для образцов плазмы положительный контроль (плазма от COV72 участника, разведенная в 66,6 раза и 7 дополнительных трехкратных серийных разведений в PBS) добавляли в каждый аналитический планшет для проверки. Среднее значение его сигнала использовали для нормализации всех других значений на том же планшете с программным обеспечением Excel перед вычислением AUC с использованием Prism v.8.4 (GraphPad). Для моноклональных антител EC ₅₀ определяли с использованием четырехпараметрической нелинейной регрессии (GraphPad Prism v.8.4).

Экспрессия белков RBD

Векторы экспрессии млекопитающих, кодирующие RBD SARS-CoV-2 (GenBank MN985325.1; S-белковые остатки 319-539) и восемь дополнительных мутантных белков RBD (E484K, Q493R, R346S, N493K, N440K, V367F, A475V, S477N и V483A) с N-концевым сигнальным пептидом IL-2 или Mu фосфатазы человека были описаны ранее ⁴⁹ .

Псевдотипный репортерный вирус SARS-CoV-2

Псевдотипированные частицы SARS-CoV-2 были созданы, как описано ранее ^1,8 . Вкратце, клетки 293T трансфицировали pNL4-3ΔEnv-nanoluc и pSARS-CoV-2-S _Δ19 . Для создания мутантных псевдовирусов по RBD использовали pSARS-CoV-2-S _Δ19 , несущий любую из следующих спайковых мутаций, вместо его аналога дикого типа: Q493R, R346S или E484G ⁵⁰ .Частицы собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и хранили при -80 ° C.

Анализ нейтрализации псевдотипированного вируса

Четырехкратно серийно разведенная плазма людей, выздоравливающих от COVID-19, или моноклональные антитела инкубировали с вирусом, псевдотипированным SARS-CoV-2, в течение 1 часа при 37 ° C. Затем смесь инкубировали с клетками 293T _ACE2 в течение 48 часов, после чего клетки промывали PBS и лизировали с помощью реагента Luciferase Cell Culture Lysis 5 × (Promega).Активность люциферазы нанолюк в лизатах измеряли с использованием системы анализа люциферазы Nano-Glo (Promega) с Glomax Navigator (Promega). Полученные относительные единицы люминесценции были нормализованы к единицам, полученным из клеток, инфицированных псевдотипированным вирусом SARS-CoV-2, в отсутствие плазмы или моноклональных антител. Полумаксимальную ингибирующую концентрацию для плазмы (NT ₅₀ ) или моноклональных антител (IC ₅₀ ) определяли с помощью четырехпараметрической нелинейной регрессии (метод регрессии наименьших квадратов без взвешивания; ограничения: вверху = 1, внизу = 0) ( GraphPad Prism).

Высокомерный анализ данных проточной цитометрии

Высокомерный анализ данных viSNE и FlowSOM и визуализация данных проточной цитометрии были выполнены на В-клетках с использованием платформы Cytobank (https://cytobank.org). Анализ viSNE был выполнен с использованием равной выборки 4893 ячеек из каждого файла FCS с 75,00 итерациями, степенью сложности 30 и тета 0,5. Следующие маркеры были использованы для создания карт viSNE: IgA, CD305, TGFb-RII, CD138, CD10, CD272, IgD, CD24, CD21, CD95, HLA-DR, IgG, CD279, CD38, IgM, CD274, CD27, CD23, CXCR5, CD32, CD86, CD40, CD85j, CD11c и CXCR3.Полученные карты viSNE были загружены в алгоритм кластеризации FlowSOM ⁵¹ . Самоорганизующаяся карта была сгенерирована с использованием иерархической консенсусной кластеризации на t -распределенных стохастических осях вложения соседей.

Визуализация тепловой карты

Тепловые карты для отображения в масштабе столбцов z — баллы средней интенсивности флуоресценции для отдельных кластеров FlowSOM в соответствии с выражением маркера были созданы с использованием тепловой карты функции R.

Биотинилирование вирусного белка для использования в проточной цитометрии

Очищенный и помеченный Avi RBD SARS-CoV-2 был биотинилирован с использованием набора Biotin-Protein Ligase-BIRA в соответствии с инструкциями производителя (Avidity), как описано ранее ¹ .Овальбумин (Sigma, A5503-1G) был биотинилирован с использованием набора EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation согласно инструкциям производителя (Thermo Scientific). Биотинилированный овальбумин конъюгировали со стрептавидином-BV711 (BD biosciences, 563262) и RBD со стрептавидином-PE (BD Biosciences, 554061) и стрептавидином-AF647 (Biolegend, 405237) ¹ .

Сортировка отдельных клеток с помощью проточной цитометрии

Сортировка отдельных клеток с помощью проточной цитометрии была описана ранее ¹ . Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови обогащали B-клетками путем отрицательной селекции с использованием набора для выделения пан-B-клеток в соответствии с инструкциями производителя (Miltenyi Biotec, 130-101-638).Обогащенные В-клетки инкубировали в буфере FACS (1 × PBS, 2% FCS, 1 мМ EDTA) со следующими антителами против человека (все в разведении 1: 200): анти-CD20 – PECy7 (BD Biosciences, 335793), анти-CD3-APC-eFluro 780 (Invitrogen, 47-0037-41), анти-CD8-APC-eFluor 780 (Invitrogen, 47-0086-42), анти-CD16-APC-eFluor 780 (Invitrogen, 47-0168 -41), анти-CD14-APC-eFluor 780 (Invitrogen, 47-0149-42), а также Zombie NIR (BioLegend, 423105) и меченные флуорофором RBD и овальбумин (Ova) в течение 30 минут на льду. Одиночные CD3 ^— CD8 ^— CD14 ^— CD16 ^— CD20 ⁺ Ova ^— RBD – PE ⁺ RBD – AF647 ⁺ B-клетки были отсортированы в отдельные лунки 96-луночных планшетов, содержащих 4 мкл буфера для лизиса (0.5 × PBS, 10 мМ DTT, 3000 единиц на мл ингибиторов рибонуклеазы RNasin (Promega, N2615)) на лунку с использованием программного обеспечения FACS Aria III и FACSDiva (Becton Dickinson) для сбора и FlowJo для анализа. Отсортированные клетки замораживали на сухом льду, а затем хранили при -80 ° C или сразу использовали для последующей обратной транскрипции РНК.

Секвенирование, клонирование и экспрессия антител

Антитела были идентифицированы и секвенированы, как описано ранее ¹ . Вкратце, РНК из отдельных клеток подвергали обратной транскрипции (SuperScript III Reverse Transcriptase, Invitrogen, 18080-044), и кДНК хранили при -20 ° C или использовали для последующей амплификации вариабельных генов IGH, IGL и IGK с помощью вложенной ПЦР и Секвенирование по Сэнгеру.Анализ последовательности выполнялся с помощью MacVector. Ампликоны из первой реакции ПЦР использовали в качестве матриц для независимого от последовательности и лигирования клонирования в векторы экспрессии антител. Рекомбинантные моноклональные антитела и Fab были получены и очищены, как описано ранее ¹ .

Вычислительный анализ последовательностей антител

Последовательности антител были обрезаны на основе качества и аннотированы с использованием Igblastn v.1.14. с системой разграничения доменов IMGT.Аннотации проводились систематически с использованием инструментария Change-O v.0.4.540 ⁵² . Тяжелые и легкие цепи, полученные из одной и той же клетки, были спарены, и клонотипы были назначены на основе их генов V и J с использованием собственных сценариев R и Perl (расширенные данные, рис. 5). Все скрипты и данные, используемые для обработки последовательностей антител, общедоступны на GitHub (https://github.com/stratust/igpipeline).

Распределение частот человеческих V-генов в антителах против SARS-CoV-2 из этого исследования сравнивалось с 131 284 220 ранее созданными последовательностями IgH и IgL ⁵³ и загруженными из cAb-Rep ⁵⁴ (база данных общих BCR человека. клонотипы доступны по адресу https: // cab-rep.c2b2.columbia.edu/). На основе 82 различных генов V, которые составляют 1703 проанализированных последовательности из репертуара иммуноглобулинов трех участников, присутствующих в этом исследовании, мы выбрали последовательности IgH и IgL из базы данных, которые частично кодируются одними и теми же генами V, и подсчитали их. в соответствии с постоянным регионом. Частоты, показанные на (Расширенные данные, рис. 5), относятся к источнику и проанализированному изотипу. Мы использовали двусторонний биномиальный тест, чтобы проверить, различается ли количество последовательностей, принадлежащих конкретному гену IGHV или IGLV в репертуаре, в зависимости от частоты одного и того же гена IGV в базе данных.Скорректированные значения P были рассчитаны с использованием поправки на частоту ложных открытий. В расширенных данных на рис. 5, 6 значимые различия отмечены звездочками (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001).

Соматическая гипермутация нуклеотидов и длина CDR3 определялись с использованием собственных сценариев R и Perl. Для соматических гипермутаций нуклеотидные последовательности IGHV и IGLV выравнивали относительно их ближайших зародышевых линий с использованием Igblastn, и количество различий считали нуклеотидными мутациями.Среднее количество мутаций для генов V рассчитывалось путем деления суммы всех нуклеотидных мутаций у всех участников на количество последовательностей, используемых для анализа. Для расчета баллов гидрофобности по шкале GRAVY ⁵⁵ мы использовали шкалу гидрофобности Гая HR, основанную на свободной энергии переноса (ккал на моль) ⁵⁶ , реализованной пакетом R Peptides (https://CRAN.R-project.org/) package = Пептиды). Мы использовали 532 аминокислотные последовательности CDR3 тяжелой цепи из этого исследования и 22 654 256 последовательности IGH CDR3 из общедоступной базы данных последовательностей рецепторов В-клеток памяти ⁵⁷ .Тест Шапиро-Уилка использовался, чтобы определить, были ли баллы GRAVY распределены нормально. Показатели GRAVY для всех 532 аминокислотных последовательностей IGH CDR3 из этого исследования были использованы для выполнения теста, и 5000 баллов GRAVY последовательностей из общедоступной базы данных были выбраны случайным образом. Значения Shapiro – Wilk P составляли 6,896 × 10 ^–3 и 2,217 × 10 ^–6 для последовательностей из этого исследования и общедоступной базы данных, соответственно, что указывает на то, что данные не были нормально распределены.Поэтому мы использовали двусторонний непараметрический тест Вилкоксона для сравнения образцов, который показал разницу в распределении гидрофобности ( P = 5 × 10 ⁻⁶ ) (расширенные данные, рис. 6h).

Тепловая карта log _{2 трансформированного} относительного кратного изменения в EC ₅₀ против указанных мутантов RBD для пар клональных антител, полученных через 1,3 и 6,2 месяца (фиг. 3e, расширенные данные фиг. 7k), была создана с помощью R пакет pheatmap (https://github.com/raivokolde/pheatmap) с использованием евклидова расстояния и Ward.2 метод кластеризации.

Биопсии и иммунофлуоресценция

Полученные эндоскопически биопсии слизистой оболочки фиксировали формалином и заливали парафином. Срезы (5 мкм) нарезали, депарафинизировали в ксилоле и регидратировали в спирте и PBS. Извлечение эпитопа, индуцированного нагреванием, выполняли в растворе для извлечения мишени (DAKO, S1699) с использованием промышленного скороварки. Затем предметные стекла охлаждали до комнатной температуры, промывали в PBS и подвергали проницаемости в течение 30 мин в 0,1% Triton X-100 в PBS. Неспецифическое связывание блокировали 10% козьей сывороткой (Invitrogen, 50062Z) в течение 1 ч при комнатной температуре.Затем срезы инкубировали с комбинацией первичных антител, разведенных в блокирующем растворе, в течение ночи при 4 ° C. Срезы промывали 3 раза в PBS, а затем инкубировали во вторичных антителах и DAPI (1 мкг мл ^-1 ) в течение 1 ч при комнатной температуре. Срезы трижды промывали PBS и затем устанавливали с помощью Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences, 1798425). Контроли включали исключение первичных антител (без первичного контроля 995) или замену первичных антител нереактивными антителами того же изотипа (изотипический контроль).Микроскоп Nikon Eclipse Ni и цифровая зеркальная камера (Nikon, DS-Qi2) использовались для визуализации и изображения ткани.

Антитело, используемое для окрашивания срезов на белок N, было продуцировано у кроликов против SARS-CoV N и обладает перекрестной реактивностью с белком SARS-CoV-2 N ⁵⁸ (дополнительная таблица 8).

SARS-CoV-2 ПЦР из биопсий кишечника

Чтобы определить, присутствует ли РНК SARS-CoV-2 в желудочно-кишечном тракте, мы выделили РНК из эндоскопически полученных биоптатов слизистой оболочки с использованием набора Direct-zol miniprep (Zymo research, R2050).КДНК с обратной транскрипцией амплифицировали с использованием набора 2019-nCov Ruo Kit (IDT) для обнаружения геномной РНК вирусного нуклеокапсида. Амплификацию субгеномной РНК нуклеокапсида выполняли с использованием следующих праймеров и зонда: sgLeadSARSCov2_F 5′-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3 ‘ ²⁸ , wtN_R4 5′-GGTGAACCAAGACGCAGTAT-3′ / ZFACGAGA / T / ZFACGAC / 5 / TGACGAC / 5 / TAGACGAC / 5 / TAGACGAC / 5 / TAGACGAC / 5 / / -3 ′.

Количественную ПЦР выполняли с использованием набора для ПЦР зонда QuantTect (Qiagen, 204345) в следующих условиях: 95 ° C 15 с, 95 ° C 15 с и 60 ° C 1 мин с использованием системы Applied Biosystem QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System.Вирусная РНК считалась обнаруженной, если C _t для комбинаций вирусного праймера и зонда было <40. Образцы из положительных лунок очищали на колонке, а наличие последовательностей N1 дополнительно проверяли секвенированием по Сэнгеру.

Обнаружение РНК SARS-CoV-2 путем лигирования близости зонда

Зонды были сконструированы с гомологией 20-25 нуклеотидов с геномной РНК SARS-CoV-2. Зонды оценивали с помощью NCBI BLAST, чтобы исключить связывание с другими клеточными транскриптами.IDT OligoAnalyzer (Integrated DNA Technologies) использовался для идентификации пар зондов со сходными термодинамическими свойствами; температура плавления 45–60 ° C, содержание GC 40–55% и низкая самокомплементарность. 3′-конец каждого из зондов, используемых для амплификации сигнала бесконтактного лигирования, сконструирован с частично комплементарной последовательностью к остову длиной 61 п.о. и частично к вставке 21 п.н. (дополнительная таблица 8). Зонды одномолекулярной флуоресценции in situ для гибридизации (smFISH) были сконструированы с дополнительным 3′-концом к зонду обнаружения биотина (дополнительная таблица 8).

Залитые в парафин образцы были нарезаны на срезы толщиной 10 мкм. Срезы депарафинизировали с использованием 100% ксилола, 5 мин при комнатной температуре, повторяли дважды. Стекла дважды промывали в 100% этаноле в течение 1 мин при комнатной температуре и сушили на воздухе. Эндогенную пероксидазную активность устраняли обработкой образцов 0,3% перекисью водорода в течение 10 мин при комнатной температуре с последующей промывкой водой, обработанной DEPC. Образцы инкубировали 15 мин при 95–100 ° C в растворе для извлечения антигена (ACDBio), промытом в воде, обработанной DEPC, и обезвожены в 100% этаноле, 3 мин при комнатной температуре и высушены на воздухе.Срезы тканей подвергали проницаемости в течение 30 минут при 40 ° C с использованием раствора протеазы RNAscope plus (ACDBio) и промывали водой, обработанной DEPC.

Гибридизацию проводили в течение ночи при 40 ° C в буфере на основе DEPC-обработанной воды, содержащей 2 × SSC, 20% формамида (Thermo Fischer Scientific), 2,5% (об. / Об.) Поливинилсульфоновой кислоты, 20 мМ рибонуклеозид-ванадиловый комплекс (New England Biolabs), 40 Ед. Мл ^-1 RNasin (Promega), 0,1% (об. / Об.) Твин 20 (Sigma Aldrich), 100 мкг мл ^-1 ДНК спермы лосося (Thermo Fisher Scientific), 100 мкг мл ^-1 дрожжевой РНК (Thermo Fisher Scientific).ДНК-зонды, растворенные в воде, обработанной DEPC, добавляли до конечной концентрации 100 нМ (Integrated DNA Technologies). Образцы кратковременно промывали и инкубировали в буфере, содержащем 2 × SSC, 20% формамид, 40 ед. Мл ^-1 RNasin при 40 ° C, а затем промывали четыре раза (по 5 мин каждый) в промывочном буфере, PBS, 0,1% (об. / v) Твин 20 и 4 ед. мл ^-1 RNasin (Promega). Затем слайды инкубировали со 100 нМ вставкой и олигонуклеотидами остова в PBS, 1 × SSC, 0,1% (об. / Об.) Tween 20, 100 мкг мл ^-1 ДНК спермы лосося (Thermo Fisher Scientific), 100 мкг мл ^-1. дрожжевая РНК (Thermo Fisher Scientific), 40 ед. Мл ^-1 RNasin при 37 ° C.После четырех промываний ткани инкубировали при 37 ° C с 0,1 Е мкл ДНК-лигазы ^-1 Т4 (New England Biolabs) в 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl ₂ , 1 мМ АТФ, 1 мМ DTT, 250 мкг мл ^-1 BSA, 0,05% твин 20, 40 ед. мл ^-1 RNasin с последующей инкубацией с 0,1 мкл ДНК-полимеразы ^-1 phi29 в 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl ₂ , 10 мМ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 250 мкМ dNTP, 1 мМ DTT, 0,05% Твин 20, 40 Ед мл ^-1 RNasin pH 7.5 при 30 ° C. Предметные стекла промывали и эндогенный биотин блокировали с использованием набора для блокирования авидин / биотин (Vector Laboratories) в соответствии с инструкциями производителя. Ампликоны с вращающимся циклом идентифицировали с использованием ДНК-зонда, меченного биотином, в концентрации 5 нМ при 37 ° C в PBS, 1 × SSC, 0,1% Tween 20, 100 мкг мл ^-1 ДНК спермы лосося, 100 мкг мл ^{— 1} дрожжевая РНК. После промывки образцы инкубировали с разведенным стрептавидином – HRP 1: 100 (Thermo Fisher Scientific) в PBS, 60 мин при комнатной температуре с последующей промывкой.Флуоресцентное мечение было выполнено с использованием Alexa Fluor 647 Tyramide SuperBoostKit (Thermo Fischer Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Hoechst 33342 использовался для ядерного контрастного окрашивания (Thermo Fischer Scientific), а образцы были помещены в золотой антифад ProLong (Thermo Fischer Scientific).

Обнаружение РНК SARS-CoV-2 с помощью smFISH

Гибридизацию проводили в течение ночи при 40 ° C в буфере на основе DEPC-обработанной воды, содержащей 2 × SSC, 20% формамид (Thermo Fischer Scientific), 2.5% (об. / Об.) Поливинилсульфоновой кислоты, 20 мМ рибонуклеозид-ванадильный комплекс (New England Biolabs), 40 ед. Мл ^-1 RNasin (Promega), 0,1% (об. / Об.) Твин 20 (Sigma Aldrich), 100 мкг мл ^-1 ДНК спермы лосося (Thermo Fisher Scientific), 100 мкг мл ^-1 дрожжевой РНК (Thermo Fisher Scientific). ДНК-зонды, растворенные в воде, обработанной DEPC, добавляли до конечной концентрации 10 нМ (Integrated DNA Technologies). Образцы кратковременно промывали и инкубировали в буфере, содержащем 2 × SSC, 20% формамид, 40 ед. Мл ^-1 RNasin при 40 ° C, а затем промывали четыре раза промывочным буфером, PBS, 0.1% (об. / Об.) Твин 20 и 4 ед. Мл ^-1 RNasin (Promega). Образцы промывали и эндогенный биотин блокировали с использованием набора для блокирования авидин / биотин (Vector Laboratories) в соответствии с инструкциями производителя. Срезы инкубировали с ДНК-зондом, меченным биотином, в концентрации 10 нМ при 37 ° C в PBS, 1 × SSC, 0,1% Tween 20, 100 мкг мл ^-1 ДНК спермы лосося, 100 мкг мл ^-1 дрожжевая РНК.